P33ING1、p53基因在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义

杨承纲 胡早秀 陈 芸

膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤，其中90% 以上是膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)。Garkavtsev等[1]采用在消减cDNA杂交(substractive hybridization)的基础上，结合GSE(genetic suppressor element)方法，克隆出1个新基因命名为inhibitor of growth 1(ING1)，ING1基因的主要蛋白翻译产物为P33ING1 蛋白。近年研究资料表明ING1是1个肿瘤抑制基因，参与细胞生长抑制、衰老、凋亡； P33ING1蛋白常被人们称为p53基因的“分子伴侣”，其对细胞生长的抑制作用是通过提高p53依赖的P21/waf1的功能，使细胞周期阻滞在G1期来发挥作用。本实验采用链霉素抗生物蛋白-过氧化酶免疫组化染色(SP)法，检测P33ING1与p53基因在膀胱移行细胞癌中的表达，并探讨P33ING1、p53基因的相关关系及其表达在膀胱移行细胞癌中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集云南省肿瘤医院病理科2000年～2007年收治的83例膀胱移行细胞癌及11例正常膀胱黏膜组织，83例BTCC中，男性63例，女性20例，年龄35～84岁，平均年龄59.5岁。行病理检查前均未接受过放疗和化疗，术后均行化疗药物膀胱灌注治疗。按WHO病理组织学分级标准，G129例，G231例，G323例；Tis～T1期(浅表性肿瘤)51例，T2～T4期(浸润性肿瘤)32例。所有标本均经10%福尔马林液固定、石蜡包埋，4 μm厚连续切片。术后随访16个月～5年，平均38个月，失访5例，肿瘤复发或转移56例，死亡2例，无复发或转移20例。

1.2 方法

羊抗人P33ING1 单克隆抗体为Santa Cruz Biotechnology公司产品，抗体稀释度为1∶50，p53单抗、SP染色试剂盒、DAB显色剂、抗体稀释液购自福州迈新公司。采用S-P法进性免疫组化染色，严格按照试剂盒说明书进行操作。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

结果判定： p53以细胞核染色呈棕黄色颗粒为阳性；P33ING1大部分阳性定位于细胞核，少部分阳性定位于细胞质，阳性染色呈棕黄色颗粒。结果判定参照文献报道[2]，每例在光镜下(400 ×)计数肿瘤细胞中阳性细胞百分比。阳性细胞数<10%为阴性，阳性细胞数≥10%为阳性。

1.3 统计学方法

2 结果

83例膀胱移行细胞癌中，42例(50.6%)p53表达阳性，49例(59.03%) P33ING1表达阳性。

P33ING1蛋白表达水平膀胱移行细胞癌 G1、G2与G3比较有显著性差异(P<0.05)，G1与G2比较其表达无显著性差异(P>0.05)；p53蛋白表达膀胱移行细胞癌G1与G2、G3比较有显著性差异(P<0.05)，G2与G3比较其表达无显著性差异(P>0.05)。P33ING1及p53蛋白表达Tis～T1与T2～T4比较有显著性差异(P<0.05)。随访5年发现复发死亡组p53蛋白表达率显著高于无复发组；复发死亡组P33ING1蛋白表达率显著低于无复发组。相关分析发现，P33ING1蛋白表达与膀胱移行细胞癌病理分级及临床分期呈负相关关系(γ=-0.263，P=0.016；γ=-0.388，P=0.001)；p53蛋白表达与其病理分级及临床分期呈正相关关系(γ=0.492，P=0.001；γ=0.341，P=0.002)； P33ING1 蛋白表达与p53表达呈显著正相关关系(γ=0.352，P=0.008 )，见表1。

3 讨论

ING1 基因是1种重要的抑癌基因，定位于人类染色体13q33-34，由外显子1a和外显子2转录翻译出的P33ING1蛋白是ING1基因的主要蛋白翻译产物 。体外实验发现，P33ING1表达降低可使细胞生长加快，而过表达可抑制细胞生长，促进细胞凋亡，对细胞周期起负调控作用[3]。其与p53有相互依赖作用，参与p53介导的多种转录调控活动，能抑制细胞生长、诱导细胞凋亡及促进损伤修复。其低表达则可刺激克隆形成，促使细胞恶性转化，导致肿瘤发生[4]。Helbing等[5]通过无血清培养的细胞死亡敏感试验，证实P33ING1 有促细胞凋亡的作用。Oki等[6]证实P33ING1 与p53基因是相互协同、相互依赖的方式，通过激活p21/WAF1的转录来对细胞生长起负反馈调节作用，两者一起表达才能起抑制细胞增殖，认为P33ING1 的异常表达阻止了p53促进细胞凋亡，从而形成了肿瘤。同样，p53不是单独发挥抑癌作用，它需要P33ING1蛋白的协同作用，共同抑制肿瘤的发生。有研究报道P33ING1蛋白在人的头颈部鳞癌、胃癌、结肠癌及乳腺癌中均有ING1基因表达下降[7]。本研究中发现，P33ING1表达在正常对照组中阳性表达率为90.90% ，而在膀胱移行细胞癌中阳性率为50.3%，表达强度明显降低，差别显著，与以上文献报道的一致，表明P33ING1失表达在膀胱癌的发生发展中可能起重要作用。

表1 P33ING1、p53蛋白表达与膀胱移行细胞癌临床病理及预后的关系(例，%)

Garkavtsev等[1]发现人成纤维细胞株中，减弱P33ING1 的表达能抑制p53调控细胞生长的功能，P33ING1 是p53蛋白发挥正常功能所必需的。单独p53基因或P33ING1 基因导致的细胞凋亡及G0/G1期阻滞要弱于两基因同时发挥功能时的状态。祝峙等[8]采用脂质体方法，将P33ING1与wtp53基因分别转染人HepG2、PLC/PRF/5和HeP3B三株内源性p53基因表达状态各不相同的肝癌细胞株，以探讨P33ING1与p53基因间的协同功能对肝癌细胞生长、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡的影响，结果发现：在表达内源性wtp53的HepG2细胞中导入外源性P33ING1基因，使P33ING1 蛋白在HepG2细胞内过表达，Western印迹结果显示在HepG2细胞内，随着P33ING1 蛋白表达量升高，p53蛋白表达也增强。过表达P33ING1 使HepG2细胞凋亡率上升，G0/G1期细胞阻滞增多。本实验结果为P33ING1 蛋白表达与p53表达呈现较明显的正相关关系，与文献报道的一致[9]。这提示，P33ING1与wtp53蛋白在核内的表达紧密相关，两者要同时存在才能发挥正常功能，当它们其中的1个失活，另1个就不能单独抑制细胞生长，这也进一步证实P33ING1与 p53基因的“分子伴侣”关系。

本实验结果表明P33ING1蛋白表达膀胱移行细胞癌 G1、G2与G3比较差异有显著性，G1与G2比较差异无显著性；p53蛋白表达在膀胱移行细胞癌G1与G2、G3比较有显著性差异，G2与G3比较无显著性差异。P33ING1及 p53蛋白表达Tis～T1与T2～T4比较有显著性差异。随访5年p53蛋白表达率复发死亡组显著高于无复发组；P33ING1蛋白表达率复发死亡组显著低于无复发组。相关分析发现，P33ING蛋白表达与膀胱移行细胞癌病理分级及临床分期呈负相关；p53蛋白表达与其病理分级及临床分期呈正相关。提示在膀胱癌中p53高表达P33ING低表达者的预后较差。鉴于野生型p53与P33ING1有相互协同及依赖关系，所以在肿瘤的形成、发展、早期诊断及基因介导治疗方面，检测p53的状态和P33ING1水平的变化情况可能有重要的意义。同时检测p53的状态和P33ING1表达水平，对膀胱癌的诊断、治疗和预后判断可能具有积极意义。

[1] Garkavtsev I，Kazarov A，Gudkov A，et a1.Suppression of the novel growth inhibitor p33/INGI promotes neoplastic transformation〔J〕.Nature Genet，1996，14(4)：415.

[2] Ma D，Lawless D，Riabowo1.Suppression of the novel growth inhibitor p33 INGI promotes neoplastic transformation(correction)〔J〕.Nature Genet，1999，23(3)：273.

[3] Garkavtsev I，Riabowol K.Extension of the replicative life span of human diploid fibroblasts by inhibition of P33 INGI candidate tumor suppressor〔J〕.Mol Cell Bid，1997，17(4)：2014.

[4] 曾凡军 ，周媛媛.p33ING1与非小细胞肺癌相关性的研究进展〔J〕.山东医药，2009，49(3)：113.

[5] Helbing CC，Veillette C，Riabowol K，et a1.A novel candidate tumor suppression P33/INGI is involved in the regulation of apoptosis〔J〕.Cancer Res，1997，57(7)：1255.

[6] Nouman GS，Angus B，Lunec J，et a1.Comparative assessment of expression of the inhibitor of growth 1 gene(INGI)in norm al and neoplastic tissues〔J〕.Hybridoma，2002，21(1)：1.

[7] Tokunage E，M aehara Y，Oki E，et al.Diminished exp ression of ING1mRNA and the correlation with p53 exp ression in breast cancers〔J〕.Cancer Lett，2000，152 (1):15222.

[8] 祝 峙，朱明华，倪灿荣.原发性肝细胞癌癌组织中P33INGIb与p53基因的表达〔J〕.中华医学杂志，2002，82(19)：1332.

[9] 李启忠，王向阳.P33ING1b在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义〔J〕.国际外科学杂志，2007，34(6):376.