Skp2在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

吕育纯 饶靖红 李爱禄 欧阳永娥

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈明显上升并且有年轻化趋势。虽然采用以手术、放疗为主的综合治疗，但近20年来总5年生存率没有明显提高。细胞周期与细胞癌变的关系是近年来肿瘤研究的热点，G1期到S期的转换失调是肿瘤形成的主要原因之一，Skp2是与此转换密切相关的细胞周期调控因子，目前国内外有关这方面的报道甚少且结果不尽相同。我们采用免疫组织化学方法，检测Skp2在宫颈癌组织中的表达情况，分析了其表达水平与宫颈癌的临床病理因素之间的关系，为临床上进一步了解宫颈癌的生物学行为、判断预后、指导治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料来源

研究对象：收集我院2002年1月至2006年12月间手术切除、并经病理检查证实的65例宫颈浸润癌石蜡标本，20例宫颈上皮内瘤样病变石蜡标本。所有研究对象具有完整的临床资料、病理资料和随访资料。所有病例均为初治者，术前未接受过放射治疗或化学治疗。

临床资料：宫颈浸润癌(invasive cervical carcinoma，ICC)组：65例患者年龄29～61岁，中位年龄43岁；﹤40岁28例，≥40岁37例。FIGO分期：Ⅰa期6例，Ⅰb期23例，Ⅱa期27例，Ⅱb期9例。大体类型：外生型37例，内生型7例，溃疡型3例，糜烂型18例。局部肿瘤大小：<4 cm者34例，≥4 cm者31例。病理诊断均为宫颈鳞状上皮细胞癌。组织学分级：高中分化癌(≤Ⅱ级)28例，低分化癌(Ⅲ级)37例。根据术后病理报告的宫颈肌层浸润程度，浸润﹤浅肌层21例，浸润≥浅肌层44例。有脉管和(或)宫旁浸润45例，无脉管和(或)宫旁浸润20例。伴有盆腔淋巴结转移12例，无盆腔淋巴结转移53例。宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)组：CINⅡ3例，CINⅢ17例；年龄35～60岁，中位年龄44岁。对照组选择同期因子宫肌瘤手术的60例宫颈正常组织(NCE)作为对照，年龄32～58岁，中位年龄45岁。3组患者年龄比较无统计学差异(P>0.05)。

1.2 方法

所有标本均经10% 中性福尔马林液固定，石蜡包埋。蜡块连续4～5 μm厚度切片，贴于涂有0.05% 多聚赖氨酸的载玻片备用。采用免疫组化S-P法检测Skp2。浓缩型Skp2鼠抗人单克隆抗体(克隆号2C8D9)，购自北京友谊中联生物科技有限公司，工作浓度为1∶200。超敏S-P检测试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司。按说明书操作。用已知阳性对照片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。每例常规进行HE染色。

1.3 结果判断

与两位病理科医师一起独立观察每张切片后作出判断。Skp2阳性表达部位主要在宫颈鳞状上皮细胞的细胞核，呈棕色或棕黄色颗粒，胞质可以有少量表达；阳性染色细胞条件为细胞结构清晰、阳性颗粒定位好、着色与背景对比清楚。综合染色强度和阳性细胞所占百分比进行半定量处理。染色强度评分标准：不着色0分，黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分；阳性细胞比例评定标准：阳性细胞数﹤5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，﹥50%为3分。2种评分得分相加，0～1分为阴性“-”，2～3分为弱阳性“+”，4～6分为强阳性“++”。

1.4 统计学分析

采用SPSS11.5版统计软件包对数据进行分析。Skp2的表达及与临床病理因素之间关系用卡方检验，生存率采用Kaplan-Meier法计算，并绘制生存曲线，生存期差别的比较及Kaplan-Meier生存曲线采用 Log-rank 检验。

2 结果

2.1 Skp2表达

Skp2在宫颈癌癌细胞核部位染色阳性，低分化或转移灶的癌细胞常出现Skp2染色强阳性，在CIN中Skp2为阳性或弱阳性，而在正常宫颈组织的基底细胞中偶尔可见胞核Skp2染色阳性。我们还观察到Skp2表达细胞在正常宫颈组织局限于增生的基底和基底旁，高分化癌位于具有角化核心的癌岛边缘，而分化差的癌Skp2表达细胞则分布于整个标本中。

宫颈癌组织中Skp2的阳性率为55.4 %，与CIN的25.0%比较有显著性差异(χ2=5.655，P=0.017)，与正常宫颈组织Skp2的阳性率(6.7%)比较有极显著性差异(χ2=34.031，P=0.000)，而CIN与正常宫颈组织Skp2蛋白的阳性率比较也有显著性差异(χ2=5.505，P=0.025)，见表1。

表1 宫颈癌、CIN及正常组织中Skp2的表达(例)

2.2 宫颈癌中Skp2的表达与临床病理因素的关系

宫颈癌中Skp2的阳性率随着肿瘤分化程度的降低表达增高，其中高、中分化癌(≤Ⅱ级)和低分化癌(Ⅲ级)Skp2的阳性率分别为39.3%和67.6%，两者比较有统计学意义(P=0.023)，见表2。

宫颈癌中Skp2的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和脉管浸润显著相关；宫颈间质浸润>浅肌层、有盆腔淋巴结转移和脉管浸润者，Skp2的阳性表达率显著高于宫颈间质浸润≤浅肌层、无盆腔淋巴结转移和无脉管浸润者，但Skp2的表达与年龄、肿瘤大小、临床分期无明显关系(P>0.05)，见表2。

Skp2阳性表达者盆腔淋巴结转移和脉管浸润的发生率分别为33.3%(12/36)和47.2%(17/36)，Skp2阴性表达者则分别为0(0/29)和10.3%(3/29)，前者盆腔淋巴结转移和脉管浸润的发生率显著高于后者(P<0.01)。

2.3 Skp2表达与宫颈癌预后的关系

宫颈癌中，Skp2阳性表达36例，平均生存期51.3个月，5年生存率52.8%(19/36)；Skp2阴性表达29例，平均生存期为59.3个月，5年生存率69.0%(20/29)，见图1。 Skp2阳性表达组的生存期及5年生存率均低于Skp2阴性表达组，经Log-rank 检验，Log-rank=8.60，P=0.0034，两者差别具有统计学意义，提示Skp2表达与宫颈癌的预后显著相关。

表2 宫颈癌中Skp2的表达与临床病理因素的关系

图1 Skp2表达阳性与阴性患者的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

3.1 宫颈癌中Skp2的表达及其意义

1995年Zhang等[1]首次发现细胞内注射p45抗体或反义寡核酸能阻断p45的功能，阻止细胞进入S期，认为p45增加与转化细胞的细胞周期控制改变有关，p45因与细胞周期蛋白cyclin A相互作用而命名为Skp2(S-phase kinase-associated proteins 2)。Skp2基因定位于人5号染色体短臂上(5p13)，分子量约45 kD。由F-box序列、“Linker”序列、蛋白-蛋白相互作用模块如亮氨酸重复序列结构域(leucine-rich repeat，LRR)依次连接构成[2]。

Skp2是泛素连接酶E3结合磷酸化p27的识别蛋白质，参与p27的泛素化降解，与细胞周期的进展，DNA的复制、细胞的增殖密切相关。Skp2能调节CDKI的降解、控制Skp1A/B与CyclinA/CDK2复合物的结合、与Skp1结合以形成SCFSkp2复合物。此外Skp2还参与转录调控，如转录因子E2F-1在G1末期积累，在S-G2期显著降低；研究发现这种降低与Skp2有关，阻断Skp2与E2F-1的相互作用可使E2F-1泛素化下调、稳定性增加[3]。Skp2还能作为某些癌基因如c-myc的联合转录因子，在其转录激活和泛素化降解中发挥重要作用，并促进c-myc诱导的S期转变和活化c-myc的靶基因[4]，而某些抑癌基因如PTEN也可能通过下调Skp2的表达而发挥抑癌作用。

肿瘤发生的根本原因在于基因组的不稳定，致使G1/S和G2/M 2个关卡失控，使本来应该停止增殖或生理性凋亡的细胞不停地进入细胞周期，因而造成细胞的恶性增生。Skp2具有促进细胞通过G1/S转换“关卡”的作用，促进细胞周期的进展，从而促进DNA的复制、细胞的增殖。因此Skp2基因被认为是1种原癌基因，具有癌基因功能。研究发现Skp2蛋白在乳腺癌[3]、前列腺癌[6]、胃癌[7]，结肠癌[8]，宫颈癌[9]等多种恶性肿瘤中表达增加。

本项研究中，我们检测到宫颈癌中Skp2的阳性率为55.4%，与Dowen等[9]在宫颈癌的研究结果相近。我们的研究结果显示Skp2在宫颈癌中特异性表达，其表达水平明显高于正常宫颈组织的6.7%和宫颈上皮内瘤样病变的25.0%，而且宫颈上皮内瘤样病变中 Skp2的阳性率也显著高于正常宫颈组织。 这一结果提示Skp2的表达在宫颈癌的发生中可能起重要作用。

3.2 Skp2的表达与临床病理因素及预后的关系

为进一步探讨Skp2在宫颈癌的发展进程中的作用，我们分析了Skp2的表达与临床病理因素的关系，发现组织学分级≤Ⅱ级的病例Skp2的阳性表达水平明显低于组织学分级Ⅲ级的病例，这表明Skp2表达水平与肿瘤的分化相关，肿瘤分化越低其表达越高，Hershko等[8]在结直肠癌病例的研究中也有相似的报道，说明Skp2表达增高不同程度地影响肿瘤的分化程度及其恶性进程。

同时我们还发现Skp2的表达水平与肿瘤的浸润深度、是否有脉管浸润密切相关，浸润深度超过深肌层组，有脉管浸润组Skp2的表达水平均明显高于不超过浅肌层组，无脉管浸润组。除此之外，Skp2的表达水平与淋巴结转移也密切相关，有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，这些临床病理因素与患者的预后密切相关。因此Skp2的上调可能与宫颈癌的恶性进展有关，其高表达提示患者预后可能不良。Shigemasa等[10]用免疫组化法检测134例卵巢肿瘤患者，发现腺瘤和低度恶性倾向肿瘤细胞中未检测到Skp2的表达，而43例腺癌细胞中检测到Skp2的表达，与前两者有显著性差异，并且晚期患者的Skp2表达检出率明显高于早期患者(P=0.01)。经Log-rank检验后发现，Skp2过度表达明显与低生存率关联，他们认为Skp2过表达提示预后不良。我们从本研究中也发现，Skp2表达阳性的病例5年生存率明显低于Skp2表达阴性的病例。进一步支持宫颈癌中Skp2的高表达与预后不良相关，Skp2的高表达是宫颈癌的高危因素之一。

综上所述，Skp2的表达升高可能与宫颈癌的发生、发展及恶性程度有关，检测Skp2的表达水平对判断宫颈癌的恶性程度和预后具有重要的参考价值，为术后辅助治疗的选择提供客观依据，具有较大的临床意义。因此，Skp2可以作为宫颈癌独立的预后指标，为宫颈癌的治疗提供新的靶点。

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[10] Shigemasa K，Gu L，O’Brien YJ，et al.Skp2 overexpression is a prognostic factor in patients with ovarian adenocarcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2003，9(5):1756.