缺氧诱导因子在分泌性中耳炎大鼠模型中耳黏膜中的表达

黄秋红 蔡小剑 张志钢 刘翔 陈穗俊 郑亿庆

目前认为分泌性中耳炎(OME)的病因主要有咽鼓管功能不良、感染(细胞生物膜机制[1])、免疫、神经能性炎症机制学说[2，3]，其中咽鼓管功能不良是主要原因[4]。咽鼓管功能不良继发中耳通气不足而引起缺氧状态下的一系列病理生理改变，如细胞因子的分泌和离子通道的改变正日益引起人们的重视。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是1992年由Semenza等[5]在缺氧状态下诱导发现的一个核因子，被认为是内环境氧平衡和调节的核心[6]，其在低氧条件下可高度表达。本研究旨在检测分泌性中耳炎模型动物中耳黏膜HIF-1α的表达，以探索其在分泌性中耳炎的病因及发病机理中的可能作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 取34只健康SD大鼠，雌雄不限，体重300～350 g，耳廓反射灵敏，鼓膜完整、呈白色、光锥清晰，声导抗检查双耳鼓室导抗图均为A型。以一侧耳建立分泌性中耳炎模型为实验组(34耳)；另一侧耳不进行任何干预为对照组(34耳)。

1.2分泌性中耳炎动物模型的建立 根据Sade[7]、Kuijpers[8]、Javier[9]采用的电极热凝及微波烧灼的方式进行改良，对实验组各耳进行咽鼓管咽口化学烧灼。术前每只动物连续灌服复方新诺明(0.5 g/kg)三天，以3 mg/kg水合氯醛行腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧位固定，取软腭正中切口切开软腭，0°或30°耳内镜下暴露咽鼓管咽口，以50%三氯醋酸烧灼一侧咽鼓管咽口，软腭切口不缝合，动物静卧待其自行复苏。术后以复方新诺明灌服，并用耳内镜定期观察模型的建立情况。OME模型建立成功的标准：采用耳内镜动态观察鼓膜内陷、积液情况，金标准为打开听泡后见鼓室内积液。

1.3中耳黏膜中HIF-1α表达的检测

1.3.1免疫组织化学法 分泌性中耳炎造模成功后，将大鼠断头处死，分别取出双侧听泡，显微镜下以细勾针剥离出中耳黏膜，以4%福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，连续4 μm厚切片，分别进行HE染色、免疫组织化学染色。按SABC 免疫组化检测HIF-1α(相关抗体及SABC 试剂盒均由武汉博士德生物技术公司提供),免疫组化步骤严格按试剂盒说明书操作。结果判断：根据Gohji等[10]的评价标准，随机选择3个或5个高倍镜视野(400倍)观察，细胞显色计分：A，细胞核、浆无显色为0分(0)；B，胞核、浆呈淡黄色云雾状为1分(+)；C，胞核、浆呈黄色颗粒状为2分(++)；D，胞核、浆呈均匀深黄色为3分(+++)。计算每张切片中染色细胞显色深浅(A、B、C、D)各占的百分比a、b、c、d，然后按A×a+B×b+C×c+D×d计算，以0分(-)、1分(+)为阴性、2分(++)为阳性，3分(+++)为强阳性。

1.3.2逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 采用Trizol法提取总RNA。采用紫外吸收法进行RNA定量,各组样品的RNA A260 /A280吸光度值均在1.8～2.0之间。逆转录合成cDNA：将所提取的总RNA采用分光光度仪测出其260 nmOD值后，采用浓度公式[RNA浓度=OD260 nm×40(稀释倍数)×40 μg·ml-1/1 000]计算总RNA浓度。同样，取2 μgRNA进行逆转录,反应体系20 μl，包括浓度为0.5 μg/μl的OligodT1 μl,5x M-MLV 缓冲液5 μl, 浓度为10 mmol/μl的dNTP2 μl, M-MLV逆转录酶1 μl，RNA 酶抑制剂1 μl ，5×buffer 4 μl及DEPC 水，RT 的条件为: 70 ℃5 min , 37 ℃5 min , 42℃ 60 min , 72 ℃10 min。cDNA 产物置- 20 ℃保存。PCR扩增：根据Gene Bank中HIF-1α的mRNA序列用primerprimier5.0软件设计引物并由上海生物工程公司合成，退火温度为 55.7℃进行聚合酶链反应，循环30次，以β-actin 基因作为内参照进行PCR(具体步骤根据说明书所示)。扩增产物经2.5%的琼脂糖凝胶电泳后，以凝胶成像系统显示，再用Bandscan5.0凝胶扫描分析系统进行DNA电泳条带灰度强度半定量分析。

1.4统计学方法 应用SPSS 11.5统计分析软件包以方差分析对数据进行统计学分析,组间比较用配对样本t检验。

2 结果

2.1OME动物模型建模情况 34只大鼠中，21只(61.76%，21/34)于烧灼后的第一天出现鼓膜松弛部内陷、充血，较术前增厚，质地变韧，表面粗糙，紧张部无明显变化；8只于术后第二天发生上述变化，3只鼓膜无明显变化，2只麻醉时死亡；19只(55.88%，19/34)于术后第二、三天出现上鼓室内陷持续，松弛部及紧张部前上及后上象限鼓膜内表面粘附淡黄色粘稠分泌物，部分锤骨柄标志欠清，鼓膜表面可见血管纹分布，8只于术后第四天出现上述变化，3只变化不大，2只第三天死亡；术后第四、五天，28只动物鼓膜完整，淡黄色分泌物在鼓膜内表面分布的面积较前增大，血管纹较前减少，2只鼓膜穿孔，剔除。28只动物术后第七天打开听泡后，14只见鼓室内多量清亮积液，造模成功，6只无明显变化，8只鼓室内见黄绿色脓性分泌物，故14只造模失败，予以剔除。

2.2逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果 正常对照组中耳黏膜HIF-1αmRNA 表达的平均灰度对数值为5.297±0.697；实验组HIF-1αmRNA表达水平升高，其平均灰度对数值为6.870±0.632,两组间差异有统计学意义(P<0.05) (图1)。

2.3免疫组织化学结果 HIF-1α主要表达于胞核,胞浆也有表达。正常对照组HIF-1α有少量表达，阳性细胞所占百分比的计分为0.500±0.149，实验组HIF-1α表达增加，其阳性细胞所占百分比的计分为1.530±0.337，两组间差异有统计学意义(P<0.05) (图2、3)。

图1 两组目的基因扩增后电泳条带图图2 实验组中耳黏膜HIF-1α的表达(SABC法×20)图3 对照组中耳黏膜HIF-1α的表达(SABC法×20)

3 讨论

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成的异源二聚体核转录因子,其中HIF-1α是主要的氧调节亚基和功能亚基，正常生理条件下在胞质内处于失活状态，在低氧条件下高度表达，是近年来研究的热门因子。它涉及到炎症渗出、血管增生、肿瘤在缺氧环境中的侵袭作用、能量代谢等各个方面，被认为是内环境氧平衡和调节的核心。它在缺氧条件下，广泛参与细胞对缺氧诱导产生的各种应答,促进血管生成、红细胞生成、促进葡萄糖转运及糖酵解增加等。

当咽鼓管功能不良或机械性阻塞时，中耳腔内的空气被吸收后得不到相应的补充，使中耳腔形成负压，导致中耳黏膜毛细血管通透性增加，浆液漏出,形成中耳腔积液，随着研究的深入，通气不良导致的中耳腔的缺氧环境已逐渐得到证实[11]，而缺氧环境下产生的缺氧诱导因子诱发一系列缺氧反应所介导的细胞因子活性上调，其中包括血管内皮生长因子、白介素-2和6、肿瘤坏死因子等并由此引起Na+-K+-ATP酶活性的下调，导致水平衡失调引起中耳积液[12～14]。但在中耳通气不良引起分泌性中耳炎的发生、发展中，HIF-1的表达情况如何及和其它因子的关系尚未见相关的报道。

文中结果表明实验组HIF-1αmRNA表达明显高于正常对照组，提示由于咽鼓管的破坏导致中耳通气不良引起的分泌性中耳炎，可诱导缺氧细胞中HIF-1α的表达，而HIF-1本身是一种细胞因子的调控基因，可引起Na+-K+-ATP酶功能障碍导致中耳积液，进一步导致听力下降[15]。目前有关分泌性中耳炎和HIF-1之间的直接关系的基础研究尚不多，HIF-1α如何通过影响各细胞因子而引起Na+-K+-ATP酶活性下调从而导致中耳积液的研究尚无报道，结合中耳腔的缺氧环境，研究细胞因子在分泌性中耳炎的发病机制和HIF-1与细胞因子之间的相互作用以及HIF-1在缺氧疾病中的核心作用，是今后的研究内容之一，将有助于认识HIF-1在分泌性中耳炎中的作用及机制，为中耳炎的预防和治疗提供新的方向和思路。

4 参考文献

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7 Sade J, Carr CD, Senturia BH. Middle ear effusion provided experimentally in dogs[J]. Ann Otol Rhinol Larygol,1959,68:1 017.

8 Kuijpers W, Vanderbeek JMH,Waillart ECT. The effect of experimental tubal obstruction on the middle ear: preliminary report[J]. Acta Otolaryngol,1988,91:75.

9 Javier V，Almudena T，Rafael R ，et al. Evolution of middle ear changes after permanent eustachian tube blockage[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2007,133:587.

10 Gohji K, Katsuoka Y, Okamoto M, et al. Human heparanase: Roles in invasion and metastasis of cancer[J]. Hinyokika Kiyo, 2000, 46: 757.

11 Clark JM,Brinson G, Newman MK, et al. An animal model for the study of genetic predisposition of middle ear inflammation[J]. Laryngoscope,2000,110:1 511.

12 Smirnova MG, Kiselev SL, Gnuchev NV,et al. Role of the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1 beta, interleukin-6 and interleukin-8 in the pathogenesis of the otitis media with effusion[J].Eur Cytokine Netw,2002 ,13:161.

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15 Poitier F,Abbeele VD.Oxygen modulated Na+absorption in middle ear epithelium[J].Am J Physiol,1999,276:C312.