唐古特白刺果粉的抗氧化作用研究

朱利娜,强 伟,史俊友,索有瑞

(1.中国科学院西北高原生物研究所,青海西宁 810001;2.中国科学院研究生院,北京 100049)

白刺 (Nitraria)是蒺藜科 (Zygophyllceae)的旱生或超旱生典型荒漠植物,其抗逆性强,耐干旱盐碱,能适应高温低寒,自然分布在干燥、盐碱、多风、植被稀少的严酷生境中,是防风固沙的优良灌木[1-2]。白刺在全世界共有 12个种,我国有 8个种,其中唐古特白刺 (Nitraria tangutorunBobr.)为我国的特有种,在我国主要分布在青海、新疆、甘肃、宁夏、内蒙古等地,资源十分丰富。

白刺是西部蒙、藏、维等少数民族的传统药材,广泛用于多种疾病的治疗,同时具有广谱的营养作用[3],经常在中藏药复方中出现。其果实长期被当地人、畜采食,具健胃、滋补、治疗消化不良等功效[4]。大量的应用基础研究工作证实白刺果实富含维生素 C、氨基酸、多糖类、黄酮、生物碱等,具有抗氧化、降血脂、防治动脉动粥样硬化的作用[5-6]。白刺丰富的营养和活性成分使其成为开发药品、保健食品及特色食品的优质原料,其产品具有广阔的应用领域和市场前景。目前,以白刺原汁通过喷雾干燥技术制成的白刺果粉不仅便于运输与储藏,还便于产品开发,可作为药品载体、食品、保健食品以及化妆品的原料和辅料。但在果粉的制备过程中,某些天然营养成分会遭到破坏和流失,为了综合评定果粉成品的质量,本文从 DPPH·、·OH·和四方面探讨了白刺果粉的抗氧化性,以期为果粉的开发和产业化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1,1-二苯基苦基苯肼自由基 (DPPH·,Sigma公司);无水乙醇、硫酸亚铁、水杨酸、盐酸、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、邻苯三酚 (焦性没食子酸)、亚硝酸钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘己二胺等均为国产市售分析纯;精密电子天平、电子恒温不锈钢水浴锅、101型电热鼓风干燥箱、Cary 300型紫外可见分光光度计 (美国 Varian公司)。

1.2 白刺果粉的制备

果粉 (青海康普生物科技股份有限公司提供),生产流程为:原料采收→果汁验收→果汁灭菌→果汁沉降→果汁过滤→果粉喷雾干燥工艺→产品检验与保存。

1.3 抗氧化活性研究

1.3.1 清除DPPH自由基能力的测定

精确配制浓度为 5×10-5mol/L的 DPPH·乙醇溶液,将白刺果粉用蒸馏水溶解,配制成系列溶液,精确吸取样品溶液 3 mL,加入 5 mL 5×10-5mol/L的 DPPH·乙醇溶液,混匀后在室温下静置30 min,以 5 mL无水乙醇和 3 mL蒸馏水的混合液为参比,测定 517 nm处的吸光值[7]。然后按下式计算DPPH自由基清除率:

式中:A0-空白对照液的吸光度 (以蒸馏水代替样品液);Ai-样品组的吸光度;Aj-样品溶液本身的吸光度 (以无水乙醇代替显色剂)。

样品溶液清除自由基能力采用清除 DPPH·的I C50值表示,即 DPPH自由基清除率为 50%时所对应的抗氧化剂溶液浓度。

1.3.2 清除羟自由基能力的测定

利用 Fenton反应法产生·OH,·OH氧化水杨酸产生有色物质,该产物在 510 nm处有强吸收峰。若体系中加入清除·OH的物质,则会减少有色物质生成,降低吸光度[8]。具体操作为:取若干支25 mL的比色管,加入 9 mmol/L FeSO40.25 mL、9 mmol/L水杨酸 -乙醇溶液 0.25 mL,不同浓度的白刺果粉溶液 5 mL,最后加入 8.8 mmol/L H2O20.25 mL启动反应,于室温下反应 1 h。加 5 mL蒸馏水稀释反应体系,在 517 nm处测定样品的吸光度A。按 1.3.1节计算方法计算清除率。

1.3.3 清除超氧阴离子自由基能力的测定

采用邻苯三酚氧化法[9]。具体操作为:在10 mL试管中加入 3 mL Tris-HCl缓冲液 (pH值8.2),1 mL不同浓度的白刺果粉溶液,25℃±0.5℃水浴平衡 20 min后,加入 0.3 mL 7 mmol/L的邻苯三酚准确反应 4 min,加入 1 mL 10 mol/L HCl终止反应,在 420 nm处测定其吸光度 A,按 1.3.1节计算方法计算清除率。

1.3.4 清除亚硝酸盐能力的测定

当加入白刺果粉溶液时,果粉中有效成分与NaNO2作用将 NaNO2消耗掉,剩余亚硝酸根在酸性条件下,能使对氨基苯磺酸重氮化,再使其与盐酸α-萘胺偶合生成红色偶联化合物,测定溶液吸光度,计算亚硝酸盐清除率。

取不同浓度的白刺果粉溶液 10 mL于 25 mL容量瓶,加入 0.01%的 NaNO2标准溶液 0.25 mL,加入柠檬酸 -磷酸缓冲溶液 (pH值 3.0)5 mL,加蒸馏水定容至刻度,37℃下反应 1 h。取 1 mL反应液于试管中,加入 0.4%(质量分数)的对氨基苯磺酸溶液 2 mL,0.2%(质量分数)盐酸α-萘胺 1 mL,摇匀放置 15 min后,用分光光度计在 544 nm处测吸光度值,按下式计算清除率求得果粉溶液对亚硝酸盐的清除能力[10]。式中:A0:未加果粉溶液的空白试验 (以蒸馏水代替)的吸光度;A:不同浓度反应液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 白刺果粉对 DPPH自由基的清除能力

1,1-二苯基苦基苯肼自由基 (DPPH·)是一种很稳定的以氮为中心的自由基,若受试物能将其清除,则提示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧化氢自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。

图1 白刺果粉浓度对DPPH·清除作用的影响

图1显示,白刺果粉对 DPPH·有很好的清除作用,开始时随着果粉浓度的增大,对 DPPH·的清除作用逐渐增强。结合图1并计算得 I C50对应的白刺果粉样液的浓度为 0.8 mg/mL。当提取物用量达到 1.2 mg/mL时,白刺果粉对 DPPH·清除率为64%,但当果粉浓度超过 1.2 mg/mL时,对 DPPH·的清除作用达到最大 65.7%,此后变化很小。

2.2 白刺果粉对羟自由基的清除能力

羟基自由基 (·OH)是最活泼、毒性最大的自由基,它可与活细胞中的任何分子发生反应,引发组织细胞病变,导致各种疾病发生和加速机体衰老,且反应速度非常快。白刺果粉对·OH的清除效果如图2所示。

图2 白刺果粉浓度对·OH清除作用的影响

由图2可知,随着白刺果粉溶液浓度的增大,清除效果逐渐增加,当果粉浓度为 4.5 mg/mL时,对·OH的清除率达到 67.4%;此后当浓度超过 6 mg/mL时,果粉对羟自由基的清除能力达到最大71.5%,说明白刺果粉对羟基自由基有一定的清除能力。

2.3 白刺果粉对超氧阴离子自由基的清除能力

图3 白刺果粉浓度对超氧阴离子清除作用的影响

由图3可知,不同浓度的白刺果粉溶液对超氧阴离子自由基的产生都有一定的抑制作用,且随着果粉溶液浓度的增加,对超氧阴离子自由基的清除效果增强,在实验条件下,对超氧阴离子自由基的清除率最大可达 83.8%,说明白刺果粉溶液对超氧阴离子自由基具有较强的清除能力。

2.4 白刺果粉对亚硝酸盐的清除作用

亚硝酸盐与仲胺在人体中易合成强致癌物质亚硝胺,而且亚硝酸盐是一种允许在肉制品加工中使用的食品添加剂,采取有效途径清除亚硝酸盐对预防癌症具有重要意义。白刺果粉清除亚硝酸盐的效果如图4所示。

图4 白刺果粉浓度对亚硝酸盐清除作用的影响

由图4可见,白刺果粉溶液对亚硝酸盐的清除率与其浓度基本成正相关,随着果粉溶液浓度的增大,清除效果逐渐增强,在实验条件下最大清除率达到 71%,白刺果粉对亚硝酸盐有很好的清除作用。

3 讨 论

Harman提出衰老的自由基学说认为,随着年龄的增长,机体器官的衰退性变化是由自由基的副作用引起的,生物体在长期的进化中体内形成了自由基产生与消除的动态平衡,但内源性的抗氧化物防御机制并不能 100%有效,膳食抗氧化剂对降低生命期间长期积累的氧化损伤更为有效和重要[12]。实验结果表明,唐古特白刺果粉具有良好的抗氧化活性,能有效清除 DPPH·、·OH、·、亚硝酸盐。利用白刺果实,结合人们现代的营养与保健观念,可以开发白刺的系列产品,如果酒、饮料、果酱、天然色素、保健食品和药品原料等,使白刺资源得到综合利用。

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