大鼠拟“衰老”胸腺细胞功能退化的机制探讨及左归丸的作用

龚张斌,金国琴

(上海中医药大学基础医学院,上海 201203)

胸腺衰老被认为是机体衰老的“指示灯”。自然衰老大鼠 HPA轴功能慢性亢进,血皮质酮浓度异常升高,病理浓度的皮质酮能阻滞细胞周期于 G1期,抑制细胞增殖,推测其也是引起胸腺萎缩、免疫功能减退、加速机体衰老的重要机制。应用补肾药物能延缓此过程,但具体机制仍不明了。本文模拟老年大鼠的高皮质酮血症,制作大鼠拟“衰老”胸腺细胞模型,从胸腺细胞增殖、周期和免疫功能角度,进一步探讨左归丸延缓胸腺依赖性免疫功能下降的药理作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24h SD乳鼠,160g±10g SD雄性大鼠,清洁级。上海中医药大学实验动物中心提供,动物许可证号SCXK(沪 )2008-0016。

1.2 主要仪器和试剂

RealPlex4型荧光定量 PCR仪(Eppendorf CO.,LTD)等。

1.3 大鼠血清的制备及方药组成

左归丸:熟地 24g,山药 12g,枸杞 12g,山茱萸12g,川牛膝 9g,菟丝子 12g,鹿角胶 12g,龟胶 12g。选用 160g±10g SD大鼠,分左归丸组和空白血清组,按文献方法制备含药大鼠血清。

1.4 胸腺基质液的制备

无菌条件下,取 24h新生乳鼠胸腺,按文献方法培养胸腺基质细胞,待细胞长满培养板孔的 80%后,完全换液,继续培养 48h,收集培养上清液,0.22μm滤器过滤除菌,-20℃保存备用。

1.5 原代培养胸腺细胞

制备胸腺单细胞悬液。应用大鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,2500r/min离心 10min,取中层淋巴细胞,PBS洗涤。取单细胞悬液接种于 6孔培养板,接种细胞量为 5×105个 /ml,置 37℃5%CO2培养箱里孵育。24h后洗涤细胞,进行后续实验。

1.6 分组及药物处理

分组:(1)正常对照组:含 15%大鼠空白血清;(2)皮质酮处理组(简称模型组):含 1×10-5M皮质酮药液,15%大鼠空白血清;(3)皮质酮加左归丸血清组(简称左归组):含 1×10-5M皮质酮药液,15%大鼠左归丸药物血清。以上各组均含 40%胸腺基质液。各组在药物处理 48h后均加入 ConA,终浓度为 5μg/ml,继续培养 48h。其中,在胸腺细胞增殖检测实验中增设 1组;(4)空白组:含 15%大鼠空白血清,40%胸腺基质液,不加 ConA。

1.7 MTT法检测胸腺细胞增殖

于 96孔细胞培养板每孔中加入 MTT试剂(5mg/ml)20μl,继续培养 4h,2500r/min离心 6min,弃上清加入 150μl DMSO,振荡 10min,酶标仪测定570nm的 OD值。

1.8 PI染色分析细胞周期分布及流式细胞仪分析

根据试剂盒实验方法,细胞固定、染色行 FCM分析。激发波长 Ex=488nm,发射波长 Em=530nm。每管样品检测 10000个细胞,全部数据经Beckman流式细胞仪自带软件获取和分析。

1.9 胸腺细胞各种目的基因 mRNA表达检测

Trizol Reagent抽提 Total RNA。合成 cDNA进行 qRT-PCR反应。p16引物如下:上游引物:5'-ATGAGTTGGGAGGAGGCAGG-3',下游引物:5'-CGGCGTTTGGAGTGGTAGAA-3'。cdk4引物:上游引物:5'-GATGCTGGAGGTCTGCGAGGAA-3',下游引物:5'-AGAGGCCACGAACATGCAAGT-3'。IL-2引物:上游引物:5'-GCCTCCTACTTATAACACACA-3',下游引 物:5'-CCTTGGGGCTTACAAAAAGAA-3'。内参GAPDH引物:上游引物:5'-GGTATCGTGGAAGAACTCATGAC-3',下游引物:5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAC-3'。扩增条件:94℃变性 30s,62℃退火 30s,72℃延伸 30s,共30个循环。通过 RNA琼脂糖凝胶电泳对 PCR产物进行鉴定。采用 SYBR Green荧光定量 PCR试剂盒,取各组 cDNA模板,利用 RealTime-PCR检测目的mRNA的 Ct值。反应体系为:2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5μl,Forward primer(10μmol/L)1μl,Reverse primer(10μmol/L)1μl,反转录产物(0.2μg)5μl,DEPC-ddH2O加至 25μl混匀 ,取 20μl加入 PCR管中。最佳反应条件为:95℃ 2min,95℃15s,60℃ 25s,72℃ 45s,共 40个循环。每组待测样本均设立 6个重复,全部反应结束之后,mRNA的变化值按公式:化值按公式:进行计算。

1.10 Western blotting法检测胸腺细胞各种目的蛋白表达水平

洗涤,细胞离心,利用蛋白抽提液提取细胞总蛋白,应用改良 Bradford法进行定量。取 2μl相同浓度的蛋白进行 SDS-PAGE电泳,利用半干转移电泳槽将胶上蛋白转至 PVDF膜,封闭加一抗,4℃过夜,PBST漂洗 4次,二抗孵育,37℃摇床 45min,PBST漂洗 4次。利用 ECL kit检测目标条带,X-光片压片、定影、显影。成像系统拍片、扫描,待分析。

1.11 数据分析

2 结果

2.1 各组胸腺细胞的增殖变化

与空白组比较,加入 ConA后正常对照组胸腺细胞 OD值显著升高。与正常对照组比较,1×10-5M皮质酮处理的模型组细胞 OD值显著降低;与模型组比较,左归组细胞 OD值显著升高。

表1 各组胸腺细胞的增殖变化

表1 各组胸腺细胞的增殖变化

注:与空白组比较:P<0.05,P<0.01;与正常对照组比较:P<0.05,P<0.01;与模型组比较:＊P<0.05,＊＊P<0.01(下同)

组 别n OD570细胞培养0h 细胞培养 120h空 白 组 6 0.618±0.03 0.108±0.02正常对照组 6 0.610±0.04 0.621±0.05模 型 组 6 0.616±0.03 0.260±0.02左 归 组 6 0.605±0.04 0.498±0.03＊＊

2.2 各组胸腺细胞周期的变化

图1显示,与正常对照组比较,模型组胸腺细胞阻滞于 G1期的细胞数量显著升高(P<0.01),G2期细胞数量显著下降,但 S期细胞数量无明显差异(P>0.05)。与模型组比较,左归组胸腺细胞处于G1期的数量显著减少,处于S期细胞数量升高(P<0.05),G2期细胞数量无明显差异。

2.3 各组胸腺细胞各种目的基因 mRNA表达的变化

2.3.1 qRT-PCR条件的优化 图2为RealTime-PCR反应得到反映核酸扩增过程的标准曲线。从图2可见,相关系数(R2)及扩增效率分别为 0.996、98%,复孔的重复性好,证明加样的误差小。熔解曲线为单一峰,证实了产物的特异性。扩增曲线呈 S形,符合荧光实时定量 PCR实验优化指标。

2.3.2 各组胸腺细胞目的基因 mRNA表达的变化 与正常对照组比较,模型组胸腺细胞 p16 mRNA表达显著升高 cdk4,IL-2 mRNA表达明显降低。与模型组比较,左归组 p16 mRNA表达明显降低,IL-2 mRNA表达显著上升,cdk4 mRNA表达无统计学差异。

表2 各组胸腺细胞目的基因 mRNA表达的变化

表2 各组胸腺细胞目的基因 mRNA表达的变化

组 别 n p16/GAPDH cdk4/GAPDH IL-2/GAPDH正常对照组 6 1.000±0.01 1.000±0.01 1.000±0.05模 型 组 6 3.192±0.13 0.769±0.130.653±0.03左 归 组 6 1.990±0.12＊＊ 0.828±0.19 1.521±0.05＊＊

2.4 胸腺细胞各种目的蛋白表达的变化

与正常对照组比较,模型组细胞 p16蛋白表达显著升高,CDK 4、IL-2、IL-2Rα蛋白表达降低。与模型组比较,左归组细胞 p16蛋白表达显著降低,IL-2、IL-2Rα蛋白表达显著升高,CDK4蛋白表达有升高趋势,但无统计学差异。

表3 各组胸腺细胞目的蛋白表达的变化

表3 各组胸腺细胞目的蛋白表达的变化

组 别 n p16/GAPDH CDK4/β-actin IL-2/GAPDH IL-2Rα/β-actin正常对照组 6 0.509±0.19 0.783±0.11 0.714±0.10 0.813±0.12模 型 组 6 1.887±0.42 0.677±0.05 0.482±0.08 0.368±0.16左 归 组 6 0.946 ±0.20＊＊ 0.694±0.08 0.784±0.11＊＊ 0.634±0.08＊＊

图1 各组胸腺细胞周期的变化

图2 GAPDH基因标准曲线

图3 各组胸腺细胞目的蛋白表达变化的Western blot图

3 讨论

细胞衰老表现为增殖能力下降,生长不可逆停滞。细胞增殖能力的关键是顺利通过细胞周期各个控制点。不同细胞周期受不同亚型细胞周期素及周期素依赖型蛋白激酶控制,从而表现出不同的增殖刺激因素易感性。胸腺细胞增殖能力与胸腺依赖性免疫功能关系密切,免疫功能可由胸腺细胞分泌细胞因子的能力来评价,反之细胞因子的分泌合成也调节胸腺细胞的增殖过程。IL-2放大 IL-2R基因的表达,后者通过蛋白酪氨酸激酶(PTK)通路,最终活化 CDK并激活周期素 E,调节胸腺细胞生长发育,激活胸腺细胞从 GO进入 G1期从而增殖。

G1期限制点是真核细胞接受外界增殖和抑制增殖信息的重要调控点。实验结果表明,应用 1×10-5M皮质酮直接作用于胸腺细胞后,细胞显著阻滞于 G1期,G2期细胞数量显著下降,出现细胞衰老的变化特点。p16-CyclinD/CDK4-pRb通路中各基因的表达及功能的改变可能是决定细胞衰老进程的最重要因素。实验发现,经皮质酮作用后,胸腺细胞p16基因的表达显著升高,CDK4表达明显降低,以致细胞停滞于 G1期。IL-2是诱导 T细胞活化最重要的细胞因子,IL-2含量下降又是胸腺细胞衰老的结果。IL-2与高亲和力 IL-2R的相互作用在免疫系统发育和调节淋巴细胞免疫中起着关键作用。IL-2R的 a亚单位即 CD25分子,是 T细胞中期活化的标志。在 ConA刺激下,皮质酮显著降低胸腺细胞IL-2、IL-2Rα的表达量,说明皮质酮能抑制胸腺细胞活化的信号传导通路,降低胸腺依赖性免疫功能。

应用补肾益气类方药调整胸腺细胞增殖能力,提高胸腺依赖性免疫功能,符合中医扶正固本延缓衰老的治则。左归丸根据阴阳互根理论,阳中求阴,阴阳并调,为治疗肾虚衰老的经典方。实验发现,采用左归丸含药鼠血清干预后,G1期细胞数量下降,S期细胞数量增加,说明左归丸血清能一定程度缓解皮质酮对胸腺细胞 G1期阻滞的程度,并提示其作用的周期时相可能位于 G1期,从而提高细胞增殖能力。同时发现,p16基因表达有显著回调,而CDK4表达无统计学差异。由此推测,左归丸鼠血清主要能通过抑制 p16基因的表达,减轻皮质酮对胸腺细胞周期阻滞的作用,从而促进胸腺细胞合成分泌 IL-2,后者又促进和放大 IL-2R基因的转录和表达,进而延缓胸腺细胞依赖性免疫功能的退化。以上结果表明,皮质酮能抑制细胞周期相关蛋白表达,提高凋亡相关蛋白表达,进而导致胸腺免疫功能退化;而左归丸可通过改善这些调控蛋白的表达,而影响胸腺细胞的增殖进程,延缓胸腺免疫功能退化。