肾炎宁对 IgA肾病血管内皮生长因子的影响

潘利敏,王月华,边 东,郭登洲,王彦凯

(1.河北省中医院肾内科,河北石家庄 050011;2.石家庄长城体检中心,河北石家庄 050017)

IgA肾病是我国最常见的原发性肾小球疾病,发病率较高,近年来观察终末期肾衰竭患者中有26.69%的患者其原发病系 IgA肾病[1]。即使是IgA肾病发病率比较低的美国,20岁 ～39岁的成人中,IgA肾病仍占原发性肾小球疾病的第一位[2]。由于 IgA肾病的发病机制复杂、涉及的因素较多,因此到目前为止,尚无治疗 IgA肾病的特效措施。我们根据中医理论,探究本病病因病机,提出“益气养阴化瘀祛湿法”,并依法组方肾炎宁治疗 IgA肾病,临床取得了较好的疗效[3,4]。鉴于此,本研究试图通过观察肾炎宁对 IgA肾病血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)的影响 ,以分析药物的关键靶点和主要途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁型 Sprague-Dawley(SD)大鼠 48只,体重220g～260g,由河北医科大学实验动物中心提供,动物合格证号 SCXK(冀)2008-1-003)。

1.2 实验用药

肾炎宁由黄芪、党参、茯苓、白术、女贞子、旱莲草、生地黄、白茅根、川芎、白花蛇舌草、三七粉、仙鹤草等组成,本院制剂室提供,按比例称取后水煎浓缩至每毫升药液含生药量 3.82g;氯沙坦由杭州默沙东制药有限公司提供,盐酸贝那普利由北京诺华制药有限公司提供。大鼠给药剂量按药理学实验动物给药方法计算,均以成人剂量(kg/d)的 10倍灌胃。

1.3 主要试剂

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),购自上海晶美生物科技有限公司,脂多糖(LPS,美国SIGMA公司),异硫氰酸(FITC)标记羊抗大鼠 IgA抗体(Serotec公司),兔抗大鼠 VEGF抗体(博士德生物工程有限公司),SABC试剂盒(Vector公司)。

1.4 主要仪器

冰冻切片机(Bright,5030),荧光显微镜(Olympus BX60),医学图像定量分析系统(北京航天大学)。

2 实验方法

按随机数字表法将实验动物分为造模组 36只,正常组 12只,造模组参考汤颖等[5]IgA肾病造模改良方法,运用脂多糖 +牛血清白蛋白 +四氯化碳(CCl4)联合造模:口服免疫原 BSA剂量较常用剂量增加 1倍,剂量 400mg/kg隔天灌胃,持续 6周;CCl4注射方式由既往的腹腔注射改为皮下注射,用诱导肝纤维化剂量的 1/3(皮下注射蓖麻油 0.5 ml+CCl40.1m l,每周 1次,持续 9周),并联合运用 LPS(分别于第 6、8周以 LPS 0.05mg尾静脉注射)。同时正常组给予蒸馏水灌胃,生理盐水尾静脉及皮下注射;9周后,将造模组动物按随机数字表分成模型组、西药组(贝那普利 +氯沙坦组)及中药组(肾炎宁组)各 12只。中药组及西药组自第 9周起灌服成人剂量每公斤体重 10倍剂量,每天 1次,连续 6周。模型组及正常组以等量蒸馏水灌胃,所有大鼠在整个实验期间均予以标准饮食。

3 检测项目及方法

3.1 临床指标检测

用代谢笼收集 24 h尿,并用按摩膀胱的方法采集新鲜晨尿,检测 24 h尿蛋白及尿红细胞。

3.2 肾组织病理

实验结束时用水合氯醛麻醉大鼠,取外围的肾皮质一部分做冰冻切片行免疫荧光 IgA检查,免疫荧光强度分级半定量标准参照国内外通用的五级法分级:低倍镜下不能显示,高倍镜下似乎可见为 ±;低倍镜下似乎可见,高倍镜下可见为 +;低倍镜下可见,高倍镜下清晰可见为 ++;低倍镜下清晰可见,高倍镜下耀眼为 +++;高倍镜下刺眼为 ++++。另一部分做常规光镜检查,用 100ml/L的中性甲醛固定,石蜡包埋切片,分别做苏木素-伊红染色(HE),过碘酸-希夫染色(PAS)染色。PAS染色结果采用北京航天大学 Motic Med6.0病理图像分析系统分析,于 200倍光学显微镜下,PAS染色的肾组织每个切片标本随机计数 10个肾小球,用鼠标标出肾小球系膜区并计算面积,同时测出毛细血管丛面积,算出肾小球系膜区占整个毛细血管丛面积的百分比[6]。

3.3 免疫组化染色

肾组织 VEGF的表达采用免疫组化方法。应用SABC法,采用多克隆兔抗大鼠 VEGF抗体,按说明书操作,阴性对照以 PBS代替一抗。免疫组化结果也采用北京航天大学病理图像分析系统分析,每张切片随机选 10个肾小球,测定其积阳性面积占整个肾小球面积的百分比(阳性面积/肾小球总面积),以每组的均值进行比较。

4 统计学处理

全部数据采用 SPSS 13.0统计软件进行处理,计量资料以均值 ±标准差表示,计量资料用±s表示,组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用 SNK-q检验法。P<0.05为差异有统计学意义。

5 结果

5.1 实验大鼠一般表现

除正常组外,各实验组大鼠在造模时均有不同程度的食欲减少、精神萎靡,且在注射脂多糖后第 2天情况加重。模型组在第 1次注射脂多糖后第 2天死亡 1只,第 2次注射脂多糖后第 2天死亡 2只,治疗组亦是在 2次注射脂多糖后第 2天分别死亡 1只,死亡大鼠均已从实验中剔除。

5.2 各组尿蛋白、尿红细胞数变化

表1显示,模型组和 2个治疗组 24h尿蛋白定量与正常组相比,正常组明显增加(P<0.01),而 2个治疗组比模型组则有显著下降(P<0.01),2治疗组比较中药组比西药组又略有降低,但无统计学差异;而模型组和治疗组的尿红细胞计数与正常组相比明显增多(P<0.01),西药组比模型组有所下降,但无统计学意义(P>0.05);中药组与模型组相比显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

5.3 光镜

表1显示,正常组肾小球和肾小管形态结构正常。模型组肾小球系膜细胞轻度至中度增生,伴系膜基质轻度至中度增多;肾小管上皮肿胀,内有较多蛋白小滴。治疗组个别节段系膜细胞轻度增生,系膜基质轻度增多,部分肾小管上皮胞质中有少量蛋白小滴,2个治疗组之间差异不明显。

5.4 肾组织免疫荧光

正常组肾小球系膜区无 IgA沉积。模型组表现为系膜区弥漫性颗粒状 IgA沉积,个别呈团块状,荧光强度为 ++～+++,表明模型复制成功。2治疗组 IgA沉积较模型组减轻,荧光强度为 +～++,肾炎宁组荧光强度略弱于西药组。

5.5 VEGF免疫组化结果

表1、图1显示,VEGF表达于足细胞、系膜细胞及内皮细胞、近曲小管上皮细胞内。正常组有弱表达。与正常组相比,模型组及各治疗组表达明显增强。治疗组 2组表达弱于模型组。

表1 各组 24h尿蛋白、尿红细胞、系膜基质沉积及 VEGF表达比较

表1 各组 24h尿蛋白、尿红细胞、系膜基质沉积及 VEGF表达比较

注:与正常组比较 :＊＊P<0.01;与模型组比较:P<0.05,P<0.01

组 别 例数尿蛋白(mg/24h)尿红细胞(个/ul)系膜基质(%)VEGF(%)正常组 12 9.55±1.72 9.11± 3.81 367.76±31.93＊＊ 5.94±1.66模型组 9 68.91±15.63＊＊ 341.35±24.56＊＊ 11.85± 4.38＊＊ 14.14±3.13＊＊西药组 11 43.54±10.83＊＊ 95.13±25.81＊＊ 8.22± 1.61＊＊ 11.51±1.92＊＊中药组 11 42.38±12.21＊＊ 3.77± 1.12 8.58± 2.23＊＊ 11.09±2.36＊＊

图1 VEGF在各组的表达

6 讨论

IgA肾病是 1组以 IgA或以 IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区沉积,临床上以血尿、伴或不伴蛋白尿为常见表现的临床病理综合征。其发病率逐年递增,随着对 IgA肾病研究的日益深入,已知其预后并不乐观。本病在中医内科中主要归属于“尿血 ”、“腰痛”、“水肿”范畴,多数患者起病隐匿,其发病与多种因素有关。但其基本病机是本虚标实。《金匮要略注》云:“五脏六腑之血,全赖脾气统摄。”脾有统摄血流在经脉中流行、防止溢出脉外的功能。脾的功能正常则血不会溢出脉外,反之,脾气亏虚、统血不力,即可导致尿血。肾气虚惫,失于封藏,也致尿血日久不愈,蛋白等精微物质从尿中流失。肾阴亏虚,阴虚火旺,灼伤脉络亦可见精微物质从尿中流失。脾虚不能运化水湿,肾虚不能化气行水,精微外泄而水液停滞,则见尿浊浮肿;病情继续发展,气血俱伤,脾肾失养,浊毒内停,三焦受阻,升降失常,水湿泛滥。“至虚之处,便是留邪之地”,病程日久,肾之络脉气阴两虚,气虚无力运血而致血瘀;阴虚火旺,煎熬津液,津亏液少则血液黏稠不畅而致阴虚血瘀,肾络瘀阻,致使肾体受损,肾用失司,导致本病的发生。总之,IgA肾病形成机理是非常复杂的,既有脾肾脏腑功能失调致气阴两虚,又有湿浊瘀血作祟。鉴于此我们提出“益气养阴化瘀祛湿法”治疗本病,并依法组方肾炎宁,临床取得了较好的疗效[3、4]。方中黄芪益气固表、利水消肿,且黄芪大补宗气,使气旺血行。党参、茯苓、白术补中、健脾、益气、祛湿,白茅根、生地黄、女贞子、旱莲草养阴补肾、凉血止血,川芎活血行气,三七粉、仙鹤草活血止血。该方标本兼顾、虚实并重,确能切中病机。

VEGF最先是在研究肿瘤的过程中被发现的,由于其强烈的促血管生长作用,故成为恶性肿瘤血管生成以及肿瘤转移的研究热点。近来研究发现,VEGF与肾脏疾病之间有密切的关系。正常情况下VEGF可表达于足细胞与近曲小管上皮细胞,但在病理情况下,系膜细胞、内皮细胞亦有表达[7,8]。Matsumoto等[9]报道了在 IgA肾病患者尿中 VEGF浓度较正常人明显增高,且处于病变活动期的患者要高于静止期的患者。师锁柱等[10]报道 VEGF在IgA肾病进展过程中发挥复杂而重要的作用,涉及增加微血管通透性、诱导细胞外基质合成、血管生成障碍等多种机制。Amemiya等[11]的研究未观察到VEGF对系膜细胞有分裂效应,但 VEGF可增加系膜细胞胶原合成,具有剂量、时间依赖性。本次研究实验结果表明,IgA肾病大鼠肾小球 VEGF蛋白表达较正常时增强,与文献报道一致,提示 VEGF在IgA肾病病变中起到重要作用。肾炎宁方能明显减少肾小球 VEGF表达,从而抑制细胞增生和细胞外基质增多,延缓 IgA肾病肾小球病变进展。肾炎宁方组与西药组(贝那普利 +氯沙坦组)比较,虽然没有显著性差异,但前者作用略优于后者,提示肾炎宁方在抑制 IgAN大鼠 CTGF表达的途径之外,可能对RAS也有阻断作用,尚有待进一步证实。

[1]陈惠萍,曾彩虹,胡伟新,等.10594例肾活检病理资料分析[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2000,9(6):510.

[2]Nair R,Walker PD.Is IgA nephropathy the commonest primary glomerulopathy among young adults in the USA[J].Kidney Int,2006,69(8):1455-1458.

[3]郭登洲,谢惠芬,王彦刚,等.肾炎宁治疗小儿 IgA肾病 25例疗效观察[J].新中医,2003,35(4):16-17.

[4]郭登洲,谢惠芬,王彦刚,等.肾炎宁治疗 IgA肾病的临床研究[J].中华实用中西医杂志,2003,3(16):215-216.

[5]汤颖,娄探奇,成彩联,等.实验性 IgA肾病模型的改进[J].中山大学学报(医学版),2006,27(2):184-187.

[6]郭啸华,刘志红,黎磊石.大黄酸对 2型糖尿病肾病大鼠疗效观察[J].中华肾脏病杂志,2002,18(4):280-284.

[7]傅思莹,陶瑜.IgA肾病进展中 MMP-2、TIMP-2与 VEGF的表达变化[J].临床与实验病理学杂志,2008,24(5)573-576.

[8]Yamagishi S,Inagaki Y,Okamoto T,et al.Advanced glycation end product-induced apoptosis and overexpression of vascular endothelial growth factor and monocyte chemoattractant protein-1 in human-culturedmesangial cells[J].JBiolChem,2002,277:20309-20315.

[9]Matsummoto K,Kanmatsuse K.Elevated vascular endothelial growth facor levels in the urine ofpatientswithm inimal-change nephrotic syndrome[J].Clin Nephrol,2001,55(4):269-274.

[10]师锁柱,陈香美,张雪光,等.血管内皮细胞生长因子及其受体在 IgA肾病患者肾组织中表达的研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2003,12(1):76-79.

[11]Amemiya T,Sasamura H,Mifune M,et al.Vascular endothelial growth factor activatesMAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells[J].Kidney Int,1999,56(6):2055-2063.