参麦注射液对脑出血大鼠脑组织 HSP70表达的影响及其神经保护作用机制的实验研究

2010-01-22 10:10黄仁发何泽云滕久祥
中国中医基础医学杂志 2010年2期
关键词:参麦神经细胞阳性细胞

黄仁发,康 雷,何泽云,滕久祥

(1.广西中医学院附属瑞康医院,广西南宁 530011;2.湖南中医药大学第一附属医院,湖南长沙 410007;3.北京中医药大学东直门医院,北京 100700)

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神经内科常见的危重急症,具有高发病率、高致死率和高致残率的特点。如何保护脑血肿周围神经细胞免于凋亡是降低脑出血高致残率的重要手段。既往我们体内外的研究表明,参麦注射液通过抑制血肿周围脑组织缺氧诱导因子-1α的表达及抗细胞凋亡等机制发挥神经保护作用[1、2]。本研究进一步探讨脑出血血肿周围脑组织热休克蛋白 70(heatshock protein 70,HSP70)的表达以及参麦注射液对其的影响,为参麦注射液应用于脑出血的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级 SD大鼠 50只,雌雄各半,体重 200g±20g,购自湖南中医药大学实验动物中心。

1.1.2 药物 参麦注射液(SM,20mg/支)正大青春宝药业有限公司生产,批号 0307136。

1.1.3 仪器和试剂 SN-3脑立体定位仪、微量注射器、AO-8205型轮转切片机、LHB11800型组织修整机、OPTON多功能光学显微镜、H-600透射电子显微镜(日本)、Ⅶ型胶原酶(sigma公司)、兔抗鼠 HSP70多克隆抗体(武汉博士德生物公司)、羊抗兔二体、SP试剂检测盒(sigma公司)、DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 按 Rosenberg[3]法造大鼠脑出血模型:大鼠腹腔注射 10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉后,俯卧位固定于立体定位仪上,局部剪毛,75%酒精皮肤消毒,头皮正中切口,暴露颅骨。使用《大鼠脑立体定位图谱》进行苍白球定位:前囟后1.4mm,中线右侧旁开 3.2mm,深 5.6mm。手术刀钻孔,用固定于立体定位仪上的微量注射器器缓慢抽取含 0.4UⅦ型胶原酶的灭菌生理盐水(0.2u/μl)2μl,校准后垂直进针 5.6mm,缓慢注射,留针5min后拔出针头,缝合皮肤,放回笼中饲养。假手术组以此方法注入等量灭菌生理盐水。

1.2.2 分组与及给药方法 按完全随机方法将 50只大鼠分为 4组:正常组 5只,普通饲养,自动饮水,不做任何处理;模型组 20只,组内随机分成脑出血后 1d、3d、5d、7d共 4个时间点,术前 24h以2m l生理盐水腹腔注射,术后仍用生理盐水注射(每天 1次),直至处死为止;参麦组 20只,动物分配及用药方法均同模型组,参麦注射液 2m l腹腔注射。假手术组 5只,普通饲养,动物分配及用药方法均同模型组,术前 24 h以 2ml生理盐水腹腔注射,术后仍用生理盐水 2m l注射,每天 1次,直至第 3天处死为止。

1.2.3 评估 造模大鼠清醒后即观察神经系统病态,后按时间点观察爬杆记分。神经系统病态包括躯体倾斜,立行欲倒,旋转爬行,活动迟缓,易激惹。爬杆长 2m,宽 2.4cm,厚 4.4 cm,一端抬高 45°,术前 3d训练大鼠由低向高爬行。计分方法为:将木条等分为 4段,每段计 6分,4段总分相加共 24分,不能爬计 6分,患肢拖行计 5分,跌下或滑倒 >3次计 4分,跌下或滑倒 <2次计 3分,四肢软弱无力计2分,四肢支撑变宽计 1分。其中 24分为大鼠爬行记分的最高分,分数越高,表示肢体功能越差。

1.2.4 肉眼观察 将实验大鼠以 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,放血处死大鼠,迅速开颅取脑组织,生理盐水轻轻洗净血污后,观察鼠血肿吸收情况。

1.2.5 组织形态学电镜观察 按上述方法取出大鼠出血侧脑组织。1%锇酸固定,0.1M PBS漂洗,梯度丙酮脱水,Epon-812包埋,在 LHB11800型组织修整机上切片,醋酸铀-醋酸铅双重染色,H-600型透射电子显微镜观察、摄像。

1.2.6 免疫组化检测血肿周围区 HIF1-α的表达 将空白切片常规脱蜡和水化,按试剂盒提供的使用方法检测 HSP70的表达。左侧非出血侧大脑半球作为对照。HSP70表达阳性的细胞在光镜下细胞浆呈棕黄色颗粒。阳性细胞计数:在 40倍光学显微镜下,观察每张切片出血中心区、出血周围区、出血侧海马区和皮质部位的每个网格(光学显摄镜 40倍下为 125μm×125μm)的 HSP70阳性细胞数。每个部位各观察 5个视野,计数各视野内的 HSP70阳性细胞,取其均值作为出血中心区、出血周围区、海马和皮质部位的阳性细胞数。

2 结果

2.1 术后大鼠神经系统病理体征

表1显示,大鼠术后平均 45min麻醉清醒,假手术组大鼠清醒后未见明显神经系统病态。模型组和参麦组大鼠清醒后均出现活动迟缓、易激惹、站立不稳,病灶对侧肢体无力、步伐增宽,爬行时躯体偏向病灶对侧,2组大鼠术后神经系统病态差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 大鼠术后神经系统病态

2.2 大鼠爬杆计分结果

表2显示,正常组和假手术组均未见明显缺陷。模型组和参麦组均在第 1天计分最高,随着时间的延长,计分逐渐下降,但参麦组大鼠 1d、3d、5d计分明显低于模型组相应时间点,差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 术后大鼠爬杆计分

表2 术后大鼠爬杆计分

注:模型组、参麦组大鼠术后 1d、3d、5d时爬杆计分比较:*P<0.01;模型组、参麦组组内各时间点爬杆计分比较:P<0.01

组 别 n 造模时间(d) 记分模 型 组 20 1 18.75±2.049*15 3 15.20±1.207*10 5 9.30±1.418*5 7无明显缺陷参 麦 组 20 1 16.70±1.41815 3 12.60±1.12110 5 7.50±0.972 5 7无明显缺陷假手术组 5 3 无明显缺陷正 常 组 5 — 无明显缺陷

2.3 肉眼观察

模型组和参麦组大鼠术后第 1天可见手术侧脑肿胀,均出现血肿,说明造模成功,血肿面积见表3,2组比较无显著性差异(P>0.05);术后第 3天血肿有所吸收,从第 5天起出血明显减轻,术后 7d明显吸收,但参麦组相对吸收明显,模型组出血灶内尚可见棕红色的凝血块,而参麦组则只见吸收后形成的中风囊。

2.4 电镜观察组织形态学变化

电镜下观察,正常组和假手术组海马 CA1区锥体细胞核呈圆形、胞体内细胞器丰富;模型组和参麦治疗组 1d海马 CA1区均出现了凋亡小体,模型组术后 3d凋亡小体增多,持续到术后 7d,细胞器结构不完整(图1),参麦组 7d时海马 CA1区毛细血管和胶质细胞水肿(图1);参麦组术后 3d凋亡小体增多,但比模型组要少(图2),7d时仍可看到凋亡小体,但细胞器结构较完整;模型组 7d时,海马 CA1区毛细血管和胶质细胞水肿严重,参麦组 7d时海马CA1区毛细血管和胶质细胞轻度水肿(图2)。

表3 2组大鼠术后 1d血肿面积比较(±s,n=5)

表3 2组大鼠术后 1d血肿面积比较(±s,n=5)

注:参麦组与模型组术后 1d血肿比较:t=0.53,★P>0.05

组 别 n 血肿面积(mm2)模型组 5 12.84±1.29★参麦组 5 13.37±1.68

2.5 大鼠脑出血后血肿中心区、缺血半暗带区、术侧海马区和皮层区 HSP70的表达

正常组和假手术组大鼠海马区和皮层区均有少量的 HSP70阳性信号表达(图3和图4),假手术组比正常组稍多,但二者比较差异有统计学意义(P>0.05)。模型组术后第 1天于血肿中心区几乎未见阳性信号表达,3d后可见少量的阳性细胞,5d时稍增多,而血肿周围区、术侧海马区和皮层区阳性信号术后 1d时即增多,3d时达到高峰(图5),以后逐渐下降,7d仍有阳性信号,各个表达部位的阳性细胞数以海马区最多,手术对侧海马区和皮层区阳性信号也有所增加;参麦组血肿周围区、术侧海马区和皮层区术后 1d时即增多,3d时达到高峰(图6),以后逐渐下降,7d仍有较多的阳性信号,比模型组要多。模型组和参麦组各时间点于各部位的阳性细胞数与假手术组、正常组相比差异有统计学意义(P<0.05);参麦组各时间点于血肿周围区、海马区和皮层区的阳性细胞数比模型组要多,2组比较差异有统计学意义(P<0.05),而 2组血肿中心区的阳性细胞数于 1d、3d、5d时差异有统计学意义(P>0.05),于 7d时模型组阳性细胞数要多,2组比较差异有统计学意义(P<0.05,见表4)。

图1 模型组第 3天(电镜 ×3500)

图2 参麦组第 3天(电镜 ×3500)

图3 正常组第 3天(×400)

图4 假手术组(×3500)

图5 模型组第 3天(×400)

图6 参麦组第 3天(×400)

3 讨论

HSP又称“分子伴侣”,是一种进化上高度保守的蛋白,具有 4个家族[4]。热休克蛋白 70(heat shock proteins 70,HSP70)是 HSPs中最保守、最主要、含量最丰富的一类,在应激后生成最为显著,它作为分子伴侣不仅参与细胞内蛋白质的折叠、装配、降解和修复过程,以维护蛋白的自稳系统,在细胞的信息传递、生长、分化中具有重要的调控作用。同时它又可以作为一种内源性保护物质对脏器损伤产生自身保护作用[5、6]。近年对脑缺血大鼠模型的研究发现,HSP70可增加细胞耐缺氧能力,通过增加神经细胞 B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukmia-2,bcl-2)的表达来抑制神经细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。

表4 大鼠脑出血后各部位 HSP 70阳性细胞数比较(±s,n=5)

表4 大鼠脑出血后各部位 HSP 70阳性细胞数比较(±s,n=5)

注:与模型组各同时间段比较:◇P<0.01,★P>0.05;参麦组与模型组组内各同时间段比较:☆P<0.01,☆☆P<0.05,●P>0.05;模型组 3d时与假手术组比较:○P<0.01;假手术组与正常组比较:P>0.05

组别血肿区 周围区 海马区 皮层区模 型 组 1d 0.16±0.20☆ 10.36±1.319◇☆ 19.84±1.864◇☆ 9.48±1.447 ◇☆3d 2.68±1.108★☆ 14.80±1.803◇☆ 28.56±2.678◇☆○ 13.96±2.865◇☆○5d 3.28±1.208★ 12.84±1.344◇☆ 23.96±1.837◇☆ 11.72±1.400◇☆7d 3.12±1.236◇● 4.28±0.843 ◇ 17.16±1.491◇ 6.40±1.080◇参 麦 治 疗 组 1d 0.20±0.408☆ 13.60±1.291☆ 24.16±1.344☆ 11.84±1.179☆3d 2.64±0.907● 29.08±2.397☆ 33.56±1.417☆ 17.44±1.044☆5d 3.44±1.895☆☆ 18.00±1.384☆ 28.08±1.470☆ 14.52±0.918☆7d 2.32±0.764 8.12±1.269 20.92±2.581 8.64±0.952假 手 术 组 3d — — 5.16±1.214 3.16±0.800正 常 组 — — 4.64±1.753 2.88±0.666

众所周知,脑出血后存在广泛的继发性缺血性损害,其血肿周围存在一个继发性缺血半暗带(ischamic Penumbra,IP),这个区域由于尚存在侧支循环,神经细胞出现的是大量的凋亡而不是坏死,且早期仅神经功能降低而依然能维持离子平衡而存活,如血流立即恢复,半暗带区域的神经细胞可恢复正常,但缺血时间过长或血流量继续下降,则神经细胞不可避免地发生坏死。脑出血无疑是一种应激状态,血肿周围组织作为对应激的反应,必将在残存的神经细胞内合成 HSP70增多,甚至有学者认为这些区域是 IP区存在的标志。而最近国内的学者也证实,脑出血大鼠血肿周围组织 HSP70的表达增加。

参麦注射液源于《干金要方》之生脉散,主要药物为人参、麦冬,其主要功效为益气养阴固脱。现代药理研究表明,参麦注射液通过抗凋亡的作用而减轻神经细胞缺血损伤,已在临床上广泛应用于治疗脑梗死,且取得较好的临床疗效。本人既往体内外的实验研究结果显示,参麦注射液可能通过促进血肿吸收、抑制血肿周围区HIF1-α表达及抑制神经细胞凋亡而发挥神经保护作用。有关参麦注射液对ICH后 HSP70表达的影响,国内尚未见报道,但王晓霞等的研究表明,参麦注射液能增加心肌缺血再灌注损伤模型心肌细胞 HSP70的表达,而减少心肌梗死面积,抑制心肌细胞的凋亡,并推测参麦注射液的保护作用系通过提高垂体-肾上腺系统的活性来增加心肌细胞 HSP70的表达而发挥增强机体抗应激能力。我们在本次实验中观察到,正常组和假手术组大鼠海马区和皮层区均有少量的 HSP70表达,模型组和参麦组术后第 1天,血肿中心区几乎不表达 HSP70,而血肿周围区、海马区和皮层区阳性信号增多,3d时增多达到高峰,7d时仍有阳性信号;同时免疫组化结果表明,血肿中心区在 3d后可见少量的阳性细胞,5d~7d时稍增多,推测这是第 3天时血肿开始吸收,神经胶质细胞及新的毛细血管增生,缺氧诱导胶质细胞和血管内皮细胞表达 HSP70,从而产生保护作用并促进机体恢复。同时我们还发现,ICH后阳性细胞数以海马区最多,结合电镜下海马CA1区同期出现凋亡小体,说明上述区域的继发性缺血可逆损伤可能通过诱导 HSP70的表达增多,从而增加神经细胞对缺氧的耐受性,发挥神经细胞保护作用。参麦组周围区、海马区和皮层区神经细胞于各时间点神经细胞的 HSP70表达明显比模型组多,提示参麦注射液可能通过增强 HSP70的表达,提高机体应激能力,增加细胞耐缺氧能力,抑制细胞凋亡,挽救继发性缺血损伤的神经细胞来促进神经功能的恢复。我们的研究为参麦注射液广泛应用于脑出血的治疗提供了理论依据。

[1]黄仁发,何泽云,史伟.参麦注射液对脑出血后大鼠神经细胞保护作用的实验研究[J].山东中医杂志,2007,26(1):42-45.

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