Ni2+胁迫对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）和集胞藻（Synechocystis sp.）的生长和光合色素的影响

赵瑾，常学秀，*，吴程，何玉芹

1.云南大学生命科学学院，昆明650091

2.云南省环境监测中心站，昆明650034

1 引言（Introduction）

重金属污染对淡水生态系统的影响日益突出，且容易通过食物链产生生物积累和放大效应.藻类是水生生态系统的重要成分之一，其生消对水生生态系统的结构和功能能够产生重要影响.水体中重金属对水生生物的毒害作用早在20世纪50年代开始就备受关注，相继开展了藻类与金属相互作用的毒理学、生理学、遗传学研究.大量的研究成果表明，当水环境中的重金属离子达到一定浓度时，就对藻类的生长代谢产生抑制作用，主要表现在：畸变藻类的细胞形态，阻止细胞分裂，破坏细胞内含物，降低酶的活性等（吴红艳等，2003;Aiken et al.,2003），并表现出随重金属浓度的升高，抑制作用增强的总体趋势.由于光合作用是藻类等光合自养生物的重要生命过程，是决定其生长和繁殖的最重要的生理基础，因此研究其在污染条件下的变化和响应，是揭示光合生物受害机理的重要内容.大量研究表明，重金属作用下藻类的光合作用受到抑制，光合放氧速率下降（Rodríguez et al.,2007），如 Lu等（2000）发现 Hg对蓝细菌的急性毒性主要是抑制了光合作用的光量子产量；3μmol·L-1的 As2O3溶液使鱼腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）光合活性下降为对照的一半（康瑞娟等，2005）；Cd2+胁迫下椭圆小球藻（Chlorellaellip soidea）细胞的光合作用受到明显抑制，光合放氧速率随Cd2+浓度的增加而逐渐降低，叶绿素的生物合成受阻，叶绿素b对Cd2+更为敏感（李建宏等，2004）.但目前重金属影响藻类（特别是形成水华的蓝藻）光合作用的进一步机理尚不十分清楚，而且在众多的重金属污染物中，对镍元素的藻类生物学效应关注比较少.以前的研究发现，镍（Ni）是生物生长必须的微量元素，但高浓度的Ni能对人类、动物、植物等会产生毒害作用（Poulik,1997）.由于蓝藻是藻型富营养化水体生态系统的重要组成成分，重金属胁迫对蓝藻生消的影响及其机理研究对于揭示水华蓝藻爆发的机制具有重要意义.

本文选取富营养化水体中常见的水华蓝藻——铜绿微囊藻和蓝藻研究模式藻种——集胞藻，研究实验室条件下Ni2+胁迫对铜绿微囊藻和集胞藻生长的影响，并从藻液的光吸收曲线、光合色素（叶绿素a、藻篮蛋白、别藻蓝蛋白）含量等指标入手，探讨了重金属对蓝藻生消的影响及其生理机制，为深入研究蓝藻在重金属胁迫下的生理生态效应及其机理提供基础数据.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 藻种培养

本研究所用的藻种为铜绿微囊藻（M. aerugonisa）FACHB-905株、集胞藻（Synechocystis sp.）FACHB-680株，均来自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库（FACHB）.采用HGZ-145培养基，置于人工气候箱恒温（26±1）℃培养，光照周期为 12:12（h）.实验设定的 Ni2+处理浓度为5mg·L-1、10mg·L-1、15mg·L-1、20mg·L-1、25mg·L-1，以不加 Ni2+的 0mg·L-1组为对照.分别于处理24h、48h、72h测定各项指标，每项实验均重复3次.

2.2 藻细胞生物量的测定

参照阎海等（2001）的方法，使用UV755B型分光光度计，自处理开始每隔24h测定藻液在663nm下的光密度（OD663nm）值表示其相对生物量.

2.3 藻细胞光谱特征的测定

采用周志刚和尹长松（2002）的方法，取5mL藻液，使用TU-1901双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），用HGZ-145空白培养基做参比，在室温下扫描350nm~800nm范围内藻液的吸收光谱.

2.4 叶绿素a含量的测定

叶绿素a含量的测定参照王永红等（2001）报道的方法.

2.5 统计分析

采用SPSS 10.0软件进行相关的统计分析和相关性分析.

3 结果（Results）

3.1 Ni2+胁迫对蓝藻生长的影响

不同浓度Ni2+处理下M.aerugonisa的生长状况如图1所示，不同浓度Ni2+处理下Synechocystis sp.的生长状况如图2所示.由图1可见，M. aerugonisa的生长明显受到Ni2+的影响.培养 24h后，藻细胞的生物量与Ni2+浓度呈极显著的负相关关系（R=-0.735，p<0.01），即随着处理时间的延长，各处理浓度下M.aerugonisa的生物量一直呈下降趋势，这说明Ni2+对M.aerugonisa的生长有明显的抑制作用.实验结果表明（图2），在处理至24h时，各浓度Ni2+处理下Synechocystis sp.的光密度 OD663值分别比对照增加了 0.52%、1.72%、2.47%、2.86%，其生长没有受到显著影响（p>0.05）.但随处理时间的推移（48h、72h），Synechocystis sp.的生物量逐渐降低，表明 Ni2+处理 48h会对Synechocystis sp.的生长产生明显的抑制作用.

3.2 Ni2+对蓝藻吸收光谱的影响

不同浓度Ni2+处理下M.aerugonisa的吸收光谱变化规律如图 3所示，不同浓度 Ni2+处理下Synechocystis sp.的吸收光谱变化规律如图4所示.从图3、图4可见，在350nm~800nm光谱范围内，两种供试藻藻细胞均出现了3个吸收峰，其中约440nm处的波峰为叶绿素a在蓝光区的吸收峰；约630nm处为藻蓝蛋白的吸收峰；约680nm处为别藻蓝蛋白和叶绿素a在红光区的吸收峰.在所有的浓度条件下，Ni2+处理使 M.aerugonisa和Synechocystis sp.藻细胞的光吸收值逐渐降低，说明Ni2+抑制了藻细胞的吸光能力.其中 Ni2+处理24h即对M.aerugonisa的吸光能力产生明显影响，而Synechocystis sp.则在处理至48h时才产生这种抑制作用.

采用SPSS 10.0软件分析Ni2+浓度与3种光合色素Chla、PC、APC光吸收峰值的相关性，结果见表 1.由表 1可见，M.aerugonisa和 Synechocystis sp.的Chla、PC、APC光吸收峰值均与Ni2+处理浓度成显著负相关.其中藻蓝蛋白（PC）与Ni2+浓度之间的负相关性最高，表明3种光合色素中受Ni2+影响最大的是PC，其次是APC、Chla.

表1 Ni2+浓度与铜绿微囊藻和集胞藻光合色素的光吸收强度相关性分析Table 1 Correlations between the concentrations of Ni2+and intensity of photosynthetic pigment of M.aerugonisa and Synechocystis sp.Cells

3.3 Ni2+对供试蓝藻叶绿素a含量的影响

Ni2+处理下铜绿微囊藻叶绿素a含量的测定结果见图5，Ni2+处理下集胞藻叶绿素a含量的测定结果见图6.由图5可见，M.aerugonisa的叶绿素a含量与Ni2+浓度呈负相关关系.但处理24h时5~ 15mg·L-1的Ni2+对M.aerugonisa叶绿素a含量有一定刺激作用，分别比对照提高 2.13%、4.31%、4.61%，但尚未达到显著水平（p>0.05）.随着处理时间的延长，叶绿素a的含量随Ni2+浓度的增加而迅速下降.由图6可见，在相同时间内，不同浓度Ni2+处理后叶绿素a含量的变化差异显著，随着处理浓度的加大，Synechocystis sp.藻细胞叶绿素a含量也相应减少，5~25mg·L-1范围内叶绿素a含量与Ni2+浓度呈现极显著的负相关关系（R24h=-0.668，p<0.01;R48h=-0.691,p<0.01;R72h=-0.709,p<0.01）.

4 讨论（Discussion）

在供试剂量的Ni2+处理下，铜绿微囊藻的生长受到抑制，随着Ni2+浓度的增加和处理时间的延长，抑制作用越明显；在处理至24h时，集胞藻的生长尚未受到Ni2+的抑制，但处理至48h后呈现出明显的抑制作用，且胁迫浓度越大、胁迫时间越长，抑制作用越明显，表现出明显的“剂量-效应”和“时间-效应”关系，Carrieri等（2008）的研究也表明Ni2+能抑制蓝藻生长，并导致叶绿素降解.光合作用是藻类等光合自养生物的重要生命过程，是决定其生长和繁殖的最重要的生理基础，叶绿素a（Chl a）、藻蓝蛋白（PC）和别藻蓝蛋白（APC）是蓝藻常见的3种重要的光合色素，其中PC和APC统称为藻胆蛋白，它们共同构成了蓝藻的捕光天线系统，光能在藻胆体中传递的顺序为PC→APC，最后传给光合作用反应中心 Chl a（Arteni et al., 2009）.藻胆体主要通过藻胆体大小、结构及数量的改变对环境作出响应（Reuter and Müller,1993），如氮饥饿能导致集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803藻胆体在相关基因控制下主动降解（Sato et al., 2008）.有报道指出，在蓝藻的类囊体膜上，由于藻胆体颗粒位于外表面，因而更易受到进入细胞内的重金属离子的作用（李建宏等，1997）.根据本文实验结果，3种光合色素对Ni2+胁迫的敏感性大小依次为PC＞APC＞Chl a，由此表明藻蓝蛋白（PC）是Ni2+的首要作用位点，王山彬等（2002）的研究也得到了类似的结果.但本课题组针对水生植物化感克藻效应及其机理的研究中发现，M.aerugonisa的APC对粉绿狐尾藻（Myriophyllum aquaticum）分泌的化感物质更为敏感、更易于受损，即APC是粉绿狐尾藻对M.aerugonisa光合系统的化感抑制靶位点（Wu et al.,2008）.这可能是由于不同环境因子对藻胆体的影响机制存在差异，且该过程受其它共存生态因子的影响和制约，如 Carrieri等（2008）发现光照强度显著地影响着Ni2+对极大螺旋藻（Arthrospira maxima）生长及叶绿素含量的影响：高光通量（100μE·m-2·s-1）下0.17、1.7、3.4、和5.0mM Ni2+处理3天后导致藻细胞生长缓慢、脱绿及黄化，且浓度越高抑制作用越强，而在低光通量（40μE·m-2·s-1）下，4.0mM Ni2+在处理初期使得叶绿素略有下降，但12d后恢复到不加镍的对照水平.

综上所述，重金属可以通过破坏藻细胞的捕光天线系统，阻断藻胆蛋白对光电子的捕获和传递，从而抑制光合作用，最终抑制蓝藻的生长和繁殖.而且随镍胁迫剂量的加大和胁迫时间的延长，蓝藻叶绿素a含量不断减少.光合色素含量和功能的降低必然导致其光合能力的下降，从而抑制藻细胞的生长，导致生物量不断降低.

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