不同pH条件下Cr6+对3种藻的毒性效应

赵娜，朱琳，冯鸣凤

南开大学环境科学与工程学院 污染过程与环境基准教育部重点实验室，天津300071

1 引言（Introduction）

我国水生态基准的制定研究零星、分散，当前我国《地表水环境质量标准》的标准值主要是参考美国各州、日本、前苏联、欧洲等国家及地区的水质基准值和标准值来确定，没有考虑我国水生态系统的区域性特征（赵娜等，2010）.水生态体系的区域性特征如水文条件、气候等多种因素都会影响污染物在水环境中的物理、化学和生物过程，因而可能导致不同的生态效应，这就要考虑到水生态系统的差异性对水生态基准的影响（孟伟等，2006）.因此，在制定水生态基准时，开展环境因子对污染物毒性影响的研究是十分必要的.

铬（Cr）在环境中广泛分布，并且广泛用于涂料、金属制造、合金和制革等工业生产中（王大勇等，2007）.铬的毒性与其存在的状态有极大的关系，自然水体中主要以三价铬（Cr3+）和六价铬（Cr6+）的形式存在，Cr6+的毒性较强，约为Cr3+的100倍，Cr6+具有强致癌变、致畸变、致突变作用（Vajpayee et al.,2000;徐衍忠等，2002）.有调查显示，Cr6+在我国的十大流域片都存在着不同程度的污染（胡必彬，2003）.在水生系统及水生食物链中，藻类作为水生动物的食物及氧气来源，占有重要位置.重金属通过各种途径进入水体后，首当其冲的受害者就是藻类生物，藻类相对细菌或水生动物而言，对毒物更敏感（邱昌恩，2006;Pascal et al.,2000）.目前已有很多关于重金属对藻类影响的研究（Rai et al.,1981;Rojickova-Padrtova and Marsalek,1999）.小球藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻是典型的代表藻种，广泛存在于我国的水体中，对其的研究已有很多报道（王莉等，2009;魏群等，2008;杨州等，2005）.

OECD（theOrganizationforEconomicCooperation and Development）提出的淡水藻生长抑制实验规范（OECD,2006）目前已被广泛应用于研究污染物对藻类的毒性的实验研究中，它已成为被国际公认的进行金属对藻类毒性风险评价的实验规范之一（Heijerick et al.,2002）.本实验按照OECD提出的淡水藻生长抑制实验规范，选取72h藻生物量为指标，研究了不同环境因子pH条件下，重金属Cr6+对小球藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻的毒性效应，旨在为研究重金属对水生生物及水生态系统的毒害作用以及我国水体质量基准和标准的制定提供科学依据.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 材料

2.1.1 藻种

小球藻（Chlorella vulgaris,FACHB-6）、斜生栅藻（Scenedesmus obliquus,FACHB-416）和铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa,FACHB-524）均购自中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库.

2.1.2 试剂

重铬酸钾（K2Cr2O7）以及配制营养液所用的药品（见表1）均购自天津市北方天医化学试剂厂，均为分析纯.

2.2 实验仪器

人工气候箱，分光光度计，生物显微镜，净化工作台，血球计数板，高压灭菌锅，pH计，照度计.

2.3 藻类培养

采用BG11培养基，由中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库提供配方.由于EDTA会与重金属形成螯合物，影响重金属的毒性（Ma et al., 2003;Calace and Petronio,2004;Zhou and Zhang, 1997），所以培养液中去掉EDTA，培养液的组成见表1，pH=8.0.

表1 BG11培养基Table 1 BG11 nutrition solution

将100mL培养液装入到250mL三角瓶中，用灭菌锅120℃高压灭菌20min，接种时在超净工作台上紫外灭菌20min.接入适量处于对数生长期的藻，放入光照培养箱，温度（25±2）℃，光照4000~ 6000Lux，光暗比为 12h:12h.每天人工摇瓶 3~4次，随机更换瓶的位置，使其受光均匀.

2.4 实验方法

EC50被认为是最精确的毒性效应值，但是它仅仅能反映不同毒物的毒性大小或者不同受体对毒物的耐受性大小，而不能用作安全暴露浓度. OECD曾推荐用NOEC和EC05、EC10或EC20置信区间的下限来作为安全暴露基准浓度（Isnard et al., 2001）.NOEC（No Observed Effect Concentrations）是指毒性作用与对照组无显著差异的最大处理浓度.有研究指出，在以NOEC为毒性效应值时，应该同时给出最小观察效应值（Van der Hoeven et al.,1998）， 即 LOEC（LowestObserved Effect Concentrations）（与对照组有显著差异的最小浓度）.

采用国际通用的“瓶法”，严格按照OECD-201淡水藻生长抑制实验指南（OECD,2006），以72h藻生物量为测试终点，计算比生长率和抑制率，采用SPSS 13.0对结果进行方差分析（ANOVA），采用多重比较Dunnett-t检验确定Cr6+对小球藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻产生效应的NOEC和LOEC（VanderHoeven,1997;周永欣等，1993;王长友等，2007;庄德辉和周晏敏，1994）并对结果进行回归分析，得出EC10和EC20.

其中，μ表示比生长率，d-1；Xj表示第j天的初始藻细胞数，mL-1，Xi表示第i天的藻细胞数，mL-1；ti某时段初始时间，d；tj表示某时段结束时间，d.

其中，I为抑制率；μc为对照组的比生长率，μt为处理组的比生长率.

2.5 预备试验

2.5.1 绘制OD-N标准曲线

表征藻生物量的方法有很多，本文以光密度（OD）值来代表藻细胞密度（N）.由于在紫外波段干扰比较多，所以在600~740nm波段对小球藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻进行全波段扫描，3种藻在690nm附近有最大吸收峰.

取一定量的藻在显微镜下血球计数板计数，并测定其吸光值，建立藻细胞密度（N）与光密度值（OD690）间的线性关系（pH=8.0），见图1.回归方程：小球藻，y=2923.775x-8.480，R2=0.996；斜生栅藻，y=2749.501x+13.246，R2=0.993；铜绿微囊藻，y=3548.449x-9.075，R2=0.999.

2.5.2 影响浓度范围的确定

用重铬酸钾配置铬贮备液2mg·L（离子浓度），过0.45μm滤膜备用.向灭菌后的100mL培养液中加入不同体积的重铬酸钾贮备液，转接处于对数生长期的藻，置于人工气候箱培养.每24h测定藻的吸光值，观察藻对Cr6+的敏感度以及Cr6+对藻产生影响的浓度范围，开始正式实验.

2.6 正式试验

2.6.1 pH对藻种生长的影响

自然水体的pH值范围一般是中性偏碱，本实验设定pH为7.0±0.2、8.0±0.2和9.0±0.2（以下简写为pH=7.0、8.0和9.0），用HCl和NaOH调节培养液的pH.接种一定量处于对数生长期的藻，每个pH设3个平行，置于人工气候箱中，每隔24h测定藻的光密度值，计算72h的比生长率.

2.6.2 pH对Cr6+毒性的影响

在pH为7.0、8.0和9.0的培养液中，加入不同体积的Cr6+贮备液，充分摇匀后接入一定量处于对数生长期的藻.设置Cr6+的处理浓度和一个空白，处理组的 Cr6+的浓度分别为 0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0和1.5mg·L（离子浓度），每个处理组设3个平行.放入培养箱中，测定72h时藻的光密度值（OD），并计算Cr6+对藻生长的抑制率，以及 Cr6+产生效应的 NOEC、LOEC、EC10和EC20值.

3 结果（Results）

3.1 不同pH条件下藻的生长

表2比较了不同pH条件下，小球藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻在72h时的比生长率.可见，小球藻在pH=7.0时生长率达到最大，说明生长最好，斜生栅藻和铜绿微囊藻在pH=9.0时生长最好.

表2 不同pH下72h藻的比生长率Table 2 The 72h specific growth rates of the alga at different pH levels

由图2可见，在pH=7.0时，小球藻在48h和72h时的生长显著高于pH=8.0和9.0（p<0.01）；在48h和72h时，斜生栅藻在pH=9.0时生长显著高于pH=7.0（p<0.01），但与pH=8.0相比没有达到显著性差异；在72h时，铜绿微囊藻在pH=8.0和9.0时生长显著高于pH=7.0（p<0.01），且pH=9.0的生长显著高于pH=8.0（p<0.05）.

3.2 不同pH下Cr6+的毒性效应

水体中三价铬和六价铬可以发生相互的转化，有研究表明随着pH的增大，六价铬的还原作用逐渐降低，当pH≥6时，六价铬的光还原反应基本消失（邓琳等，2008）.本工作中依据《水和废水监测分析方法》（国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会，2006），采用二苯碳酰二肼法，测定反应开始和结束时水体中的Cr6+的含量.结果显示Cr6+基本没有被还原.因此本实验的结果可以被认为都是Cr6+的毒性效应.

在72h时测定藻的光密度值，计算各个浓度Cr6+对藻生长的抑制率，以剂量-效应关系作图（见图3），并对结果进行统计分析，得出不同pH条件下的NOEC、LOEC、EC10和EC20，结果列于表3、表 4和表5.

表3 不同pH值下小球藻的NOEC、LOEC、EC10和EC20Table 3 The NOEC,LOEC,EC10and EC20of Chlorella vulgaris at different pH levels

表4 不同pH值下斜生栅藻NOEC、LOEC、EC10和EC20Table 4 The NOEC,LOEC,EC10and EC20of Scenedesmus obliquus at different pH levels

表5 不同pH值下铜绿微囊藻的NOEC、LOEC和EC20Table 5 The NOEC,LOEC and EC20of Microcystis aeruginosa at different pH levels

由图3可见，对于小球藻而言，Cr6+在低浓度时产生了刺激效应，当Cr6+浓度达到0.1mg·L-1，在pH=8.0时对小球藻产生了显著的抑制作用；而pH=7.0和9.0时Cr6+对小球藻产生了刺激作用，且随着浓度的增大，抑制作用增强；当Cr6+浓度达到0.5mg·L-1时，对小球藻产生的抑制率分别为1.33%、4.96%和 2.99%，Cr6+对小球藻的毒性在pH=7.0时最小，在pH=8.0时最大；对于斜生栅藻而言，Cr6+浓度达到0.5mg·L-1时，在pH=7.0、8.0和9.0条件下产生的抑制率分别为12.17%、8.02%和5.87%，Cr6+对斜生栅藻的毒性在pH=9.0时最小，在pH=7.0时最大；对于铜绿微囊藻而言，Cr6+浓度达到0.5mg·L-1时，在pH=7.0、8.0和9.0条件下产生的抑制率分别为 58.34%、55.78%和52.75%，Cr6+对铜绿微囊藻的毒性在pH=9.0时最小，在pH=7.0时最大.

由表3可见，pH=7.0时，Cr6+对小球藻的毒性效应值NOEC、LOEC、EC10和EC20最大，这说明在pH=7.0时，Cr6+对小球藻的毒性效应最小，而在pH=8.0时，效应值最小，说明其毒性最大；同样，由表4可见，pH=9.0时，Cr6+对斜生栅藻的毒性最小，pH=7.0时毒性最大；由表5可见，pH=9.0时，Cr6+对铜绿微囊藻的毒性最小，pH=7.0时毒性最大.以上结果表明，在藻的最适生长pH条件下，Cr6+对藻的毒性最小，即在最适pH条件下，藻对Cr6+的抗性最大.

比较以上3个表中的结果，同样在最适生长pH条件下，毒性效应值EC20大小顺序为：铜绿微囊藻（pH=9.0）<斜生栅藻（pH=9.0）<小球藻（pH= 7.0）；同样在生长较差的pH条件下，毒性效应值EC20大小顺序为：铜绿微囊藻（pH=7.0）<斜生栅藻（pH=7.0）<小球藻（pH=9.0），这说明Cr6+对铜绿微囊藻的毒性要比对小球藻和斜生栅藻的大，即铜绿微囊藻对Cr6+更加敏感.

4 讨论（Discussion）

由表2和图2可见，小球藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻在不同pH条件下，生长速度不同.藻类生长与藻本身的生理特点以及温度、光照、营养盐、其它生物、pH等诸多环境因素有关，水体pH是一个重要的生态因子，与藻类生长关系密切.不同藻类有一定的pH适应范围，即使同一属的两种藻，在不同pH下，其生长也可能有很大差别（刘春光等，2005）.水体pH主要从两方面对藻生长产生影响，一方面改变环境酸碱度，酸性太强（H+浓度高）或碱性太强（OH-浓度高）都会对藻细胞产生伤害，只有在适宜的酸碱度范围内，藻细胞才能正常生长繁殖；另一方面水体pH是影响碳酸盐平衡系统以及不同形态无机碳分配关系，从而对藻类生长产生影响（许海等，2009）.有资料表明，小球藻的最适pH值为6.0~7.0（张丽君等，2001），斜生栅藻的最适pH值为9.0~10.0（许海等，2009），铜绿微囊藻的最适pH值为8.5~9.5（金相灿等，2004），这与本实验结果一致.

图3比较了不同pH值条件下，Cr6+对小球藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻的抑制率.在不同的pH条件下，相同浓度的Cr6+对藻产生毒性作用不同，且有种类差异，表明pH对Cr6+的毒性效应产生影响. Cr6+对不同藻产生的毒性强度不同，在较大浓度下，都产生了显著的抑制作用，且都随着浓度的增大，抑制效应增强.结果表明，在藻的最适pH条件下，Cr6+的毒性最小，即在最适pH条件下，藻对Cr6+的抗性最大.且Cr6+对铜绿微囊藻的毒性大于小球藻和斜生栅藻的毒性，铜绿微囊藻对Cr6+更为敏感，这同许多研究结果一致（郑春艳和张庭廷，2008;Ma,2005）.

重金属对藻类的毒性作用取决于金属元素的形态、浓度、环境因素和重金属元素之间的相作用，也取决于实验藻种及藻类细胞的生理生化过程.其中影响重金属毒性的环境因素主要有pH值、温度、光照、溶氧及螯合剂等（高为和张烨，2009;姜彬慧和林碧琴，2000）.以往的研究多注意到水体pH的变化会影响金属的化学形态，从而导致其毒性有所不同（Kim et al.,1999;Park et al., 2009;孔繁翔等，1997;Peterson,1990）.本研究发现即使Cr6+的形态在pH值为7~9的范围内无明显变化，也会造成对不同藻种的毒性效应不同，这说明藻本身的生理特性也是影响重金属毒性的主要因素之一.本实验中，小球藻、斜生栅藻和铜绿微囊藻的最适生长pH分别是 7.0、9.0和 9.0，而Cr6+在最适pH条件下，对这3种藻的毒性分别也是最小，表明藻生长较好时，对毒物的抗性较大.

一般在确定污染物的环境基准时，只考虑对所选择典型代表生物的毒效应，很少一并考虑环境因素.但从生态学角度，环境因素的影响不可忽视.我国幅员辽阔，不同流域/区域水环境生态特征、水环境承载力等都有很大的差异（孟伟等，2006）.由于水生态体系的局域性特征如水文条件、气候、群落的生态机构等多种因素都会影响污染物在水环境中的物理、化学和生物过程，因而可能导致不同的生态效应.因此，在制定我国的水质标准时，要充分考虑到环境因子对污染物毒性的影响.

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