中药复方“促孕散”中生物碱的提取方法及其促孕活性研究

邵会娟,李炳奇,唐利容,刘勤兴,谷新利

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2石河子大学化学化工学院,石河子832003)

目前,由淫羊藿、益母草等中药组合而成的中药复方已被广泛的用于治疗奶牛持久黄体、卵巢静止、卵巢囊肿、卵巢萎缩、子宫内膜炎等不孕症。学者们[1～4]先后分别对不同中药复方的临床试验也均表现出良好的效果。中药复方“促孕散”由淫羊藿、益母草等九味中药组成,在治疗母畜卵巢静止和持久黄体引起的不孕症方面临床效果显著,副作用小,安全性好,治愈率可达80%[5,6]。但其作用机理、药物的活性成分尚不明确,因此其内在有效成分不能确定和控制,并且作为传统中药散剂,其用量偏大,不利于临床实际操作。

益母草是大多数中药复方中的主要成分,在兽医临床中可用于母畜不孕、母牛带下、子宫内膜炎、胎动不安、牛胎衣不干等产科疾病的治疗[7],其主要活性成分是盐酸水苏碱和益母草碱等生物碱。因此,可拟定盐酸水苏碱作为本复方中生物碱的重要质量指标。

为了进一步定量地深入研究“促孕散”的药理机制,使临床兽医和药检部门控制该产品的质量标准,确保疗效有一定的检测手段,本研究以“促孕散”复方中君药益母草中盐酸水苏碱的含量为评价指标,通过正交试验考察了超声波法提取“促孕散”中生物碱的主要影响因素[8,9],优化了提取工艺,并通过小鼠子宫增重[10,11]、卵巢发育试验,初步探讨了“促孕散”中生物碱提取物对小白鼠子宫增重和卵巢发育的影响,以期为实现“促孕散”安全,稳定,高效,可控的质量要求奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品与试剂

中药复方“促孕散”(由石河子大学动物科技学院提供);21日龄昆明种雌性小白鼠(石河子大学实验动物中心提供)。

乙醇(分析纯);盐酸水苏碱标准品(上海融禾医药科技发展有限公司);雷氏盐(上海迈坤化工有限公司);盐酸(分析纯);蒸馏水;苯甲酸雌二醇注射液(2mg/mL,批号080414,宁波市三生药液有限公司)用甘油稀释成50μg/mL。

1.1.2 主要试验仪器

紫外-可见分光光度计(BLUESTAR,北京莱伯泰科仪器有限公司);超声波提取仪(KQ5200B型,江苏省昆山市超声仪器有限公司);循环水式真空泵(SH-C,河南巩义市英峪予华仪器厂);电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);DKS系列恒温水浴锅(嘉兴中新医疗仪器有限公司);旋转蒸发仪(RE52-05,上海亚荣生化仪器厂);Olympus显微镜。

1.2 方法

1.2.1 “促孕散”中生物碱的含量测定

1.2.1.1 供试品溶液制备

称取若干份中药样品各1.00g于三角烧瓶,加入乙酸乙酯10mL浸泡1h,超声5min,过滤,药渣再加乙酸乙酯10mL,超声 5min,过滤,挥干溶剂,用60%乙醇溶液10mL为溶剂,在常温下超声提取3次,每次20min,减压抽滤,滤液用同一浓度的乙醇定容于25mL容量瓶中,作为供试品溶液待用。

1.2.1.2 标准曲线的绘制

以105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱为标准品,用试剂空白为对照,于520nm波长处测定其吸光度,用空白试剂吸光度减去对照品的吸光度,以吸光度的差值为纵坐标(吸光度的差值为被反应掉的雷氏盐,它与样品物质溶液浓度成正比),浓度为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程:

A=0.3456c+0.0128,

其中,相关系数 r=0.9996,生物碱浓度在0.05～0.25mg/mL时与吸收度呈线性关系,如图1所示。

图1 盐酸水苏碱苷对照品溶液的标准曲线Fig.1The standard curve of Hydrochloric acid stachydrine reference substance

1.2.1.3 生物碱的含量测定

准确移取8mL供试品溶液于50mL烧杯中蒸干,加入10mL0.10mol/L的盐酸溶解,水浴加热,加入0.5g活性炭边加热边搅拌1min,过滤至25mL容量瓶中,用0.1mol/L的盐酸溶液10mL分次洗涤烧杯,洗涤液滤并入同一容量瓶中;各加入新制2%雷氏盐溶液3mL,摇匀,加0.1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度,摇匀。置冰水浴放置1h,用干燥滤纸滤过,取续滤液。

测其吸光度,测定吸光度按回归方程计算供试品溶液中盐酸水苏碱的浓度c,按下列式(1)计算提取物中生物碱的含量。

式(1)、(2)中,m1为提取物生物碱的质量,mg;c为供试品溶液中生物碱浓度,mg/L,由标准曲线方程计算出;a为测定时提取液的稀释倍数;V为提取液总体积;m2为供试品溶液中生物碱的含量百分比。

1.2.1.4 “促孕散”中生物碱提取的正交试验

称取若干份中药样品各1.00g于三角烧瓶,加入乙酸乙酯10mL浸泡1h,超声5min,过滤,药渣再加乙酸乙酯10mL,超声5min,过滤,挥干溶剂,分别加入一定浓度的乙醇溶液10mL为溶剂,常温下分别超声提取一定次数,每次提取一定时间,减压抽滤,各滤液分别用同一溶剂浓度的乙醇定容于25mL容量瓶中,作为供试品溶液待用。

在单因素试验的基础上,对影响中药复方“促孕散”中生物碱提取效果的乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数4个因素,每个因素选择3个水平,选用L9(34)正交表进行试验方案设计。试验设计见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平设计Tab.1 The level of factor in the orthogonal experimental design

1.2.2 “促孕散”中生物碱提取物促孕活性指标的测定

1.2.2.1 “促孕散”生物碱提取物的制备

准确称取“促孕散”群药粗粉适量,按照超声提取“促孕散”生物碱最优工艺进行提取,收集滤液,减压浓缩除去溶剂,用蒸馏水稀释并酌情加入适量助溶剂,制为相当于1g/mL生药的溶液(用时按需要稀释)。

1.2.2.2 “促孕散”生物碱提取物对小白鼠子宫增重的影响[12,13]

取21日龄健康雌性小白鼠,随机分组,每组10只,分别为:生物碱提取物组、正常组(生理盐水)及雌二醇阳性对照组。除雌二醇阳性对照组外,生物碱提取物组和正常组灌服给药,0.06g/只,1次/d,连续给药7d。雌二醇阳性对照组从第4d开始腹腔注射,5μg/只,连续给药 7d。各组于末次给药后24h,脱颈处死小鼠,剖开腹腔,摘取子宫、卵巢及阴道,放于滤纸上,除去脂肪组织和卵巢后,迅速称子宫湿重,计算子宫与体重的比值。

1.2.2.3 “促孕散”生物碱提取物对小白鼠卵巢的影响

取21日龄健康雌性小白鼠,随机分组:每组10只,分别为:生物碱提取物组、正常组(生理盐水)及雌二醇阳性对照组。除雌二醇阳性对照组外,生物碱提取物组和正常组灌服给药,0.06g/只,1次/d,第4d剂量加倍,连续给药7d。雌二醇阳性对照组从第4d开始腹腔注射,5μg/只,连续给药7d。各组小白鼠均于第8d剖杀,立即切取双侧卵巢投入10%中性福尔马林中固定,常规石蜡切片,苏木素-伊红染色,显微镜下测定卵泡直径。将卵泡按大、中、小三类分别计数,求其百分比。卵泡分类标准:直径在100μm以上为大型卵泡;直径在100μm以下的有卵泡腔卵泡为中型卵泡;无卵泡腔的最小卵泡为小型卵泡[14]。

1.2.2.4 数据处理

所得数据采用 SPSS11.0软件进行统计学处理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 生物碱提取的正交试验结果

正交试验结果见表2。

试验结果(表2)表明,生物碱的最佳超声提取条件为:乙醇浓度60%,提取时间20min,提取3次,料液比1∶10。各因素对生物碱的提取率影响大小依次为料液比、溶剂浓度、超声提取次数、提取时间。

表2 L9(34)正交试验设计及结果分析Tab.2L9(34)orthogonal experimental designand the analysis of the result

2.2 验证试验结果

准确称取5份中药样品(各1.00g)于三角烧瓶中,根据以上正交实验筛选所得最佳提取工艺条件对中药"复方促孕散"平行提取5次。重复单因素试验,过滤,滤液分别用紫外分光光度计测定吸光度,并计算出中药中盐酸水苏碱的含量。

由表3可知,按最优提取工艺提取“促孕散”生物碱得生物碱含量为1.1477%。

表3 验证试验Tab.3verification test

2.3 “促孕散”生物碱提取物促孕活性

2.3.1 子宫增重结果

子宫与体重之比值的统计结果见表4。

从试验结果(表4)可以看出,与空白组相比,“促孕散”生物碱提取物组均明显促进小鼠子宫增重(P<0.01),但与雌二醇组相比差异不显著。

2.3.2 卵巢的发育影响

各组小鼠卵巢中各种类型卵泡所占百分比和最大卵泡直径测定结果见表5。

从表5可以看出,雌二醇组、“促孕散”生物碱提取物组与空白组相比大型卵泡数量百分比的差异极显著(P<0.01);大型卵泡最大直径与正常组差异显著(P<0.01)。各组与空白组的中型卵泡数量百分比差异显著(P<0.01);各组小型卵泡数量百分比极显著低于正常组(P<0.01)。

表4 各组对雌性的小鼠子宫的影响Tab.4 The effect on the uterine of the female Musmusculus albus in different group

表5 小鼠卵巢中各种类型卵泡百分比及最大卵泡直径Tab.5The percentage of three typus of ovarian follicle and the max follicular Diameter

3 讨论

目前,益母草制剂中盐酸水苏碱的含量测定应用较多的方法有用高效液相法、薄层扫描法和超声提取法,但前两种方法的前处理过程较复杂,且成本昂贵,本研究采用的超声法对“促孕散”中生物碱的最佳提取工艺为:溶剂60%乙醇,料液比1∶10,超声提取次数3次,每次20min;测得的生物碱含量达1.1477%。这与张师愚等[15]利用95%乙醇超声提取益母草中生物碱的效率接近,比吴海林等[16]等应用HPLC法对益母草中盐酸水苏碱的提取效率略低。与常规提取方法相比,超声波提取具有提取时间短,提取效率高,成本低等特点。因此,超声法是中药复方制剂中生物碱提取的一种较理想方法。

中药复方中包含大量的植物茎叶,其色素成分会影响试验中生物碱含量测定结果,试验中采用等剂量乙酸乙酯和活性炭双重除色法,有效地降低了色素对试验结果的影响,减少了试验误差。

利用小鼠子宫增重法检测药物的雌激素活性是一种最常用的评价雌激素作用的方法[17]。本研究中的活性试验结果表明,给予雌性小鼠生物碱提取物后,小鼠子宫增重作用明显。这表明,“促孕散”生物碱有促进小鼠子宫发育的作用。

卵泡成熟的程度是衡量卵巢发育的重要依据之一。本试验结果显示,生物碱提取物组连续灌服给药7d后,该组小鼠的大型卵泡比例为36.68%,比空白组提高了5倍,差异极显著,而中型卵泡数量比空白组反而要少。空白组的中型卵泡数量最多,大型卵泡数量极少。这说明灌服生物碱提取物后促进了中型卵泡向大型卵泡的发育,提示:生物碱提取物能促进卵巢发育,促使性成熟形态学特征提前出现,启动新的发情周期。

本试验确认了中药复方“促孕散”生物碱有较强的活性作用,能够促进小鼠卵泡发育。

[1]蒲林春,赵海梅.加减四物汤疗奶牛不孕症[J].中国兽医杂志,2007,43(5):58-60.

[2]张虎社.桃红香附饮加减治疗母牛卵巢机能不全及排卵延迟[J].中国兽医志,2004,(3):37-38.

[3]李焕章.复方仙阳汤治疗奶牛不孕症疗效浅议[J].畜牧兽医科技信息,2007,(12):69.

[4]吴乃科,万发春,候士钦,等.应用中药提高繁殖母牛繁育率技术研究[J].山东农业科学,2000,(6):42-44.

[5]罗瑞卿,谷新利.促孕散治疗奶牛卵巢疾病引起不孕症的研究[J].石河子大学学报(自然科学版),2009,27(4):455-457.

[6]谷新利,罗瑞卿,李玉梅,等.中药促孕散和理囊散的急性与蓄积性毒性实验研究[J].石河子大学学报(自然科学版),2010,27(5):602-604.

[7]张立伟,刘忠仁.益母草在兽医临床中的应用[J].养殖技术顾问,2008,(5):128.

[8]罗 毅,周本宏,马郁文.超声法提取益母草中总生物碱的正交试验研究[J].山西医药杂志,2007,36(10):948-949.

[9]蒲含林,郑元升,麻建军.超声法提取金鸡纳生物碱的工艺[J].暨南大学学报(自然科学版),2008,29(3):329-330.

[10]徐淑云.药理实验方法学·第2版[M].北京:人民卫生出版社,2002.

[11]李明辉,吕占军.貉发情期卵巢和子宫解剖结构的观察[J].现代畜牧兽医,2009,(3):29-30.

[12]王大伟,邓秀兰,王继峰.二仙汤雌激素样作用的实验研究[J].北京中医药,2008,27(9):728-730.

[13]赵丕文,王大伟,王玲巧,等.用小鼠子宫增重法筛选淫羊藿等10种中药雌激素样作用的实验研究[J].北京中医药大学学报,2006,29(10):686-689.

[14]胡鹏飞,黄贺,刘云波,等.PMSG对性未成熟昆明小鼠卵巢和子宫的影响及组织学研究[J].黑龙江动物繁殖,2005,13(2):5-7.

[15]张师愚,柴士伟,巩长芹,等.益母草中生物碱的提取与益母草膜剂的制备[J].药剂制备,2007,16(8):980-981.

[16]吴海林,甄录旭,方宗华,等.HPLC法测定益母草中盐酸水苏碱的含量[J].安徽医药,2008,12(7):597-598.

[17]Shelbymd. Assessing environmental chemicals for estrogenicity using a combination of in vitro and in vivo assay[J] . Environ Health Perspect ,1996 ,104 :1296-1300.