山羊膝关节僵直动物模型的建立

黄哲元,袁 志,卫 磊,穆尚强,刘建敏,李鹏斌,阚成双,李 岩,张 伟,于忠英

(第四军医大学附属西京医院骨科,陕西西安 710032)

膝关节僵直常见于膝关节及其周围组织结构损伤或手术后长时间制动的病例[1]。临床上通常采取功能锻炼、理疗和手术松解等治疗,但仍有相当多的患者治疗效果并不理想。长期以来,对膝关节僵直的治疗一直是骨科领域未能很好解决的一个世界性难题。而建立膝关节僵直动物模型是探索其有效治疗新方法、解决该难题的重要一环。检索相关资料,却未发现理想的膝关节僵直动物模型,因此本研究拟使用雄性山羊建立膝关节僵直实验动物模型,为下一步探索其相关有效治疗方法提供模型基础。

材料与方法

1 实验分组

成年雄性山羊 3只(第四军医大学动物实验中心提供),年龄 18～24个月,体重 (30±5)kg。每只山羊将左膝设为实验组,行手术固定 8周;以右膝为对照组,未予手术固定。

2 模型制备

速眠新Ⅱ号注射液 (长春军事医学科学院军事兽医研究所 )0.2ml/kg肌肉注射麻醉,麻醉后取仰卧位并置于无菌台。在左膝关节前侧做 2～3cm的横行皮肤切口,切断髌韧带,翻转髌骨。用骨膜剥离器向近侧剥离上关节囊,显露股骨远侧干骺端前侧,用骨挫将干骺端前侧骨面及大腿前侧肌群深面挫成粗糙面;屈曲膝关节以暴露上下关节面,用直径2mm的克氏针在上下关节面对称各钻 4个骨洞直达干骺端松质骨内,将髌韧带重叠缝合;用 2mm直径的克氏针交叉固定膝关节于伸直位,术毕管型长腿石膏加固膝关节于伸直位。术前及术后肌肉注射青霉素 20万 U各 1次。术后回放饲养圈中继续喂养。

3 膝关节活动度检测

3.1 术后 8周(去除固定即刻),活体膝关节活动度测量:术后 8周,麻醉下拆除左膝长腿管型石膏,拔除克氏针。用长臂量角器,测量双膝关节被动活动度范围;另将肢端平伸后悬挂 2.0kg秤砣,测量双膝关节相同垂直负荷下的屈曲角度。

3.2 术后 12周(去除固定 4周),活体膝关节活动度测量:去除固定后,将山羊置于饲养圈中自由活动4周。活动 4周(术后 12周)后,麻醉下用长臂量角器,测量双膝关节被动活动度范围;另将肢端平伸后悬挂 2.0kg秤砣,测量双膝关节相同垂直负荷下的屈曲角度(见图 1)。

图1 去除固定 4周将山羊手术膝肢端悬挂 2.0kg秤砣后,仍保持僵直状态

3.3 术后 12周(去除固定 4周),离体标本膝关节最大屈曲角度:活体测量后立即将羊处死,切取双膝关节标本(留取关节远近侧骨段约7.0cm),用 MTS880型材料测试机(MTS公司,美国)对比检测双膝标本在 50Ncm屈曲的力矩下的屈曲角度。具体方法:将山羊处死,于胫骨和股骨在距关节线 7cm处截断,切取双侧膝关节;去除皮肤,保留所有肌肉、肌腱和关节囊。将测试机两个夹具分别插入标本的股骨和胫骨的髓腔,并用牙托粉固定;将夹具与材料测试机上下两端连接。以 5mm/m in的加载速率给膝关节施加大小为 50Ncm屈曲的力矩,记录双膝关节的最大屈曲角度(见图 2)。实验过程中始终用生理盐水保持标本的湿润。

4 取手术膝与非手术膝关节前侧关节囊 5mm×5mm×5mm,常规甲醛固定,石蜡包埋,切片,进行免疫组织化学染色(见图 3a、b)。光学显微镜下 400×观察肌成纤维细胞的数量及其占全部细胞细胞数量的百分比。将手术膝与非手术膝进行比较,统计学方法采用配对 t检验。

图2 以 5mm/min的加载速率给僵直膝关节施加50Ncm屈曲的力矩后所得的僵直角度

图3 a、b分别为手术膝与非手术膝前侧关节囊免疫组织化学染色切片(IHC, ×400)。黄色开放箭头所指为血管组织,蓝色实心箭头所指为部分肌成纤维细胞。可见手术膝前侧关节囊较对侧血管组织减少,肌成纤维细胞明显增多

结 果

制动后山羊平均体重较前减少 5%。解除制动后,山羊体重逐渐恢复。3只山羊手术膝与非手术膝术后 8周及术后 12周分别测关节活动度(见表1、2)。其中术后 12周离体手术膝与非手术膝的最大屈曲角度通过 MTS880型材料测试机测得(见表3)。光镜观察结果显示手术膝前侧关节囊肌成纤维细胞的总数及其占全部细胞细胞数量的百分比明显多于非手术膝前侧关节囊(P＜0.05)。

表1 术后 8周时活体膝关节活动度测量

表2 术后 12周时活体膝关节活动度测量

表3 术后12周时离体标本膝关节最大屈曲角度

讨 论

1 造模的目的

膝关节是人体最大最复杂的滑膜关节,由股骨下端、胫骨上端和髌骨组成,骨与骨之间借关节囊、关节内外韧带和内外侧半月板相连,它有传递负荷、保存运动量和提供包括小腿在内的活动动力匹配的功能。外伤和手术是造成关节僵直的重要原因,由于下肢骨折长期制动、膝关节及关节周围创伤或炎症引起关节的滑动装置纤维化、挛缩、黏连而导致其僵直、功能障碍。表现为膝关节屈曲受限甚至伸直位僵直,股四头肌挛缩、弹性及活动度减小,髌骨活动度减小或消失。临床常用的治疗方法包括推拿按摩、手法松解、药物、小针刀松解、股四头肌成形术、关节镜下黏连松解术等。但以上方法治疗效果均不甚理想[2-4]。其中部分手术治疗可能取得较好的短期疗效,然而术中获得的活动范围往往在术后难以长期保持。因此,需要进一步探索一种能更简便有效治疗膝关节僵直的新方法。

根据膝关节僵直的临床特点,我们设计制造了一种外固定架渐进牵拉装置。该装置利用杠杆、缆线与滑轮作用原理,通过外固定架及缆线对小腿远端进行缓慢逐步紧缩牵拉,使小腿以膝关节为轴随时间渐进屈曲,达到膝关节屈曲活动范围逐步增大的目的。其作用原理是在持续应力作用下,引导组织发生生物再塑形。在投入临床实验之前,需要建立一种能适用的动物实验模型,以验证该器械的有效性。我们查阅了以往文献报道的多种模拟人类关节僵硬的动物模型,物种包括兔、鼠、猴子和狗等[5,6]。但这些动物模型均为膝关节屈曲挛缩性僵硬,尚没有膝关节僵直的动物模型。因此,我们选择具有体型较大、实验配合度高、抗病力强等优点的本地雄性山羊制造膝关节僵直模型。

2 造模的方法和依据

导致关节僵直公认的损伤机制包括:(1)关节内骨破坏、关节积血;(2)伸膝装置(股中间肌)与股骨远端前侧骨面疤瘢黏连;(3)韧带损伤:(4)关节长期伸直位制动。临床上关节僵直患者后期关节僵直的严重程度和初始关节周围软组织损伤程度呈正相关。因此我们尝试通过以下程序制造出具有持续性僵直的膝关节动物模型。这一程序包括:(1)控制性关节内骨破坏、关节积血(克氏针于关节面钻孔);(2)用骨锉将伸膝装置(特别是股中间肌)与股骨远端前侧骨面造成损伤;(3)髌韧带重叠缝合;(4)交叉克氏针联合管型石膏伸直位固定关节 8周。

关节内控制性骨破坏及关节积血既是关节僵直的主要原因,同时也是制造关节僵直动物模型的关键。过去传统的造模方法是在动物膝关节股骨髁的两侧去除部分骨皮质形成骨窗[7]。Fukui等[7]认为这种方法既可以产生关节内控制性骨破坏,还可以产生关节内出血。在本实验中,我们没有采取以上在股骨髁部位开骨窗的方式制造骨折,而是直接用交叉克氏针在膝关节表面非负重面钻孔。这种方法同样可以达到制造稳定性关节内骨折并造成关节内出血的目的,同时也简化了操作的步骤。

由于创伤或手术导致的韧带损伤以及伸膝装置(股中间肌)与股骨远端前侧骨面瘢痕黏连被认为是导致人类多数急性关节损伤后关节僵直的原因之一。因此我们在造模过程中增加了对伸膝装置(股中间肌)与股骨远端前侧骨面的破坏。我们的结果显示以上措施有助于膝关节僵直动物模型的建立。

多数损伤后出于缓解疼痛和减少炎症反应的需要常常对关节进行制动。但是延长制动对关节活动不利,大量的实验研究和临床证实,长期制动可产生结缔组织挛缩外,还包括肌肉的萎缩、僵硬和变弱,以及骨关节炎的形成,制动是其中主要的原因之一。有证据表明对关节内骨折进行外固定处理的时间都＞8周。有实验证明,5～10周的制动,关节僵硬的严重程度没有明显的差异[7]。因此我们选择8周作为制动时间。目前已经有多种制动方式应用于关节僵硬的实验动物模型,包括石膏、外固定、克氏针内固定或钢板、螺钉等[8-11]。我们选择制动方式以简单有效为标准。以克氏针交叉固定为基础,考虑到动物的实验依从性较差,为确保关节制动的确实有效,我们另外加上了关节外管型石膏加强固定。8周后一并拆除石膏和克氏针解除固定。

既往的膝关节僵硬动物模型多数在解除制动后,关节活动度会逐渐恢复,原有的僵硬角度会出现全部或部分丢失[12-14]。因此我们在解除山羊膝关节制动后继续观察了 4周并测量重新手术膝与非手术膝的僵直角度。我们发现手术膝关节并没有出现明显的僵直角度丢失。由此我们认为,本实验中的山羊动物模型具有和人类僵直膝关节相似的持久性。

3 造模的效果

为检验动物模型膝关节僵直的程度是否符合本实验的初始要求,我们采用多种测量方式进行测量比较,分别在术后 8周测量活体以及术后 12周分别测量活体和离体的双膝关节僵直程度。实验结果表明,无论是在术后 8周还是在解除制动的术后 12周,手术膝均较对侧出现明显的伸直性膝关节僵硬。并且术后 12周和术后 8周比较,山羊手术膝的僵直程度没有出现明显的丢失。因此我们认为上述膝关节僵直动物模型可以实现了实验的目的,并且该模型具有和人类僵直膝关节相似的持久性。在实验过程中,我们发现术后 12周时山羊活体和离体膝关节僵直程度存在差别,这种差别可能是由于离体测量标本去除了表面皮肤以及人为测量误差所致。

总之,我们研究的结果显示当合并骨、膝韧带破坏和伸直位制动可导致山羊膝关节严重和持久的伸直位僵硬。这种山羊膝关节僵直模型具有造模简便、僵直角度不易丢失以及适应性广等特点。因此,该动物模型的建立为未来的药物和矫形支具干预提供了更有潜力的实验对象。

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