米曲霉F16原生质体的制备和再生研究

刘源慧 郑 毅 王 娅 邓琳芬

米曲霉F16原生质体的制备和再生研究

刘源慧 郑 毅 王 娅 邓琳芬

福建师范大学生命科学学院

目的：研究菌龄、酶液组成、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂、培养基成分等因素对米曲霉F16原生质体制备和再生的影响。结果表明，米曲霉原生质体制备和再生的最佳条件是：菌龄15h，酶液为0.75%纤维素酶、0.75%蜗牛酶、0.5%溶菌酶的混合酶液，酶解时间2.5h，温度为28℃，最适原生质体再生培养基为含有0.6mol/L NaCl的PDA培养基。

米曲霉 原生质体 制备 再生

米曲霉（）是一类产复合酶的菌株，生产的酶类包括蛋白酶，淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等[1]，在造纸、食品、饲料、生产曲酸、酿造等工业中应用十分广泛。在实际生产中，米曲霉的产酶能力往往欠佳。如果能对米曲霉进行人工改造以提高其酶活,将会在一定程度上提高生产效率,降低生产成本。目前关于米曲霉的育种，主要采用物理和化学的诱变方法。自Emerson[2]首次报导得到粗糙脉孢菌的类原生质体结构以来,丝状真菌原生质体的研究已经取得了长足的进步，广泛运用于真菌遗传学的理论研究和育种实践。与之相关的原生质体诱变、融合、转化等技术是如今行之有效的菌种选育方法,愈加受到人们的重视,已经有许多的成功报道[3-4]。然而原生质体制备和再生是与原生质体相关的生物技术的关键环节。因此本文对米曲霉原生质体的制备和再生条件进行研究，为基于原生质体技术基础上的融合和基因组改组技术奠定夯实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株

米曲霉F16为本实验室保藏菌株

1.1.2 主要试剂

蜗牛酶(Snailase)；为厦门泰京生物有限公司产品；

纤维素酶(Cellulase),溶菌酶(Lysozyme)均为国药试剂；

其他常规试剂均购自上海生工和中国医药上海化学试剂公司。

1.1.3培养基

（1）PDA固体培养基(g/L)：马铃薯200；葡萄糖20；琼脂 20；pH 6.8

（2）马丁培养基(g/L)：KH2PO41；MgSO4·7H2O 0.5；蛋白胨 5；葡萄糖 10；琼脂 15-20；pH 6.8

（3）查氏培养基(g/L)：蔗糖30；NaNO33；KH2PO41；KCl 0.5；MgSO4·7H2O 0.5；FeSO40.001；麸皮10；琼脂 15-20；pH 6.8

（4）PMA固体培养基(g/L)：葡萄糖 40；KH2PO41；NaNO32；KCl 0.5；FeSO40.01；MgSO4·7H2O 0.5；NaCl 38；琼脂 15；酵母膏 2；PH 6.0

（5）酵母膏培养基（g/L）：酵母膏5；蔗糖10；琼脂粉15

（6）再生培养基：添加0.6mol/L的NaCl配制

1.2 方法

1.2.1菌丝体培养

从斜面上洗下的新鲜成熟孢子，调整孢子浓度在107个/mL，转接入铺有一层无菌玻璃纸的查氏固体培养基中，每皿接种量0.2mL，于28℃恒温箱中静置培养数小时备用。

1.2.2酶液的配制

用0. 6mol/L NaCl或其它不同渗透压稳定剂配制,经0.22μ微孔滤膜过滤除菌,保存于4 ℃冰箱备用。

1.2.3原生质体的制备与再生

刮下玻璃纸上长好的菌丝体于50mL离心管中，加入10mL酶液,放置于适宜温度的水浴振荡器中进行酶解，并定时吸取少量酶解液用血细胞计数板计数。酶解完毕后，酶解液用4层无菌镜头纸过滤，除去菌丝体碎片，滤液3000r/min离心10min，除去上清液，用渗透压稳定剂离心洗涤2次后重悬浮于适量渗透压稳定剂中，得到纯化的原生质体[5]。用渗透压稳定剂对上述原生质体进行了稀释,使之达到一定的浓度，取0.2mL接种于再生培养基上，28℃恒温培养2d～3d。同时，取纯化的原生质体用无菌水适当稀释后放置30min，在未加入渗透压稳定剂的低渗固体培养基上涂布培养，作为对照，计算再生率。

再生率=(再生固体培养基上菌落数-低渗固体培养基上菌落数)/原生质体数×100%

2 结果和讨论

2.1 菌龄的选择

微生物的生理状态尤其是菌龄，是决定原生质体形成量的主要因素之一。丝状真菌分离制备原生质体时常采用年轻的菌丝，一般认为对数前期和对数期效果最好。对于丝状菌的原生质体再生来说，通常认为年轻细胞再生能力比衰老细胞要强。本实验发现当米曲霉培养时间为15h时，原生质体的形成量最大，达到1.92×106个/mL,再生率最高值出现在13h时，达到22%（图1）。综合考虑，选择15h的菌龄作为原生质体制备和再生的材料。

图1 菌龄对原生质体制备和再生的影响

2.2 酶液组成的选择

不同微生物由于其细胞壁成分不同，用于破壁的酶种类也不相同。霉菌细胞壁的结构及组成比较复杂，主要由纤维素、几丁质组成。要想获得大量具有活性的原生质体，首先要根据壁物质选择合适的酶，其次酶的浓度也要适当，酶量过低，作用会不彻底，酶量过高，会影响原生质体的数量和活性。

2.2.1单一酶液对原生质体形成量的影响

分别单独采用0.5%、1%、1.5%、2%的蜗牛酶、纤维素酶、溶菌酶找寻各自制备米曲霉原生质体时的最佳酶量。结果发现单独使用蜗牛酶裂解米曲霉时，其最佳浓度为1.5%，单独使用纤维素酶的时候最佳浓度也为1.5%，单独使用溶菌酶的时候最佳浓度为1%。

2.2.2酶解液的复合配比对原生质体形成量的影响

上述单一酶对米曲霉原生质体的制备效果不甚理想，这可能是由于真菌细胞壁较复杂，而使用单一的酶不能有效水解其细胞壁。考虑到裂解反应中各个酶之间的累积效应和各个酶之间可能存在的影响，选取各自最佳浓度的一半作为复合酶液中的基本浓度来进行混合，同时按照一定的步长扩充各个酶的取值范围，以此寻求原生质体形成量最大时的酶浓度配比。结果表明制备米曲霉原生质体时以混合酶液的效果较好，其中第二组原生质体形成量最大（表1），故确定以0.75%蜗牛酶、0.75%纤维素酶、0.5%溶菌酶配制的混合酶液作为裂解液。

表1 酶液配比对原生质体制备的影响

2.2.3 酶解时间的选择

酶液处理菌丝体细胞壁的过程是一个渐进的过程，随着酶解时间的延长，原生质体的数量也会增加，但是如果裂解时间过长，原生质体的数量则会减少，并且对原生质体的再生也不利。在最佳酶液和菌龄条件下分别对不同酶解时间的原生质体进行计数及再生实验。如图2所示，酶解2.5h时原生质体的再生率最高，形成量也最大，可达3.5×106个/mL。

图2 酶解时间对原生质体制备和再生的影响

2.2.4酶解温度的选择

温度能影响菌丝体细胞壁的结构性疏散以及形成的原生质体的活力。研究不同温度对米曲霉F16制备和再生的影响。结果如图3，在28℃时原生质体的再生率最高，而生成量在30℃时最大，达到2.94×106个/mL。综合考虑，本实验采用28℃作为原生质体的酶解温度。

图3 酶解温度对原生质体制备和再生的影响

2.2.5渗透压稳定剂的选择

原生质体由于脱去细胞壁，对外界环境变化很敏感。渗透压稳定剂能够为酶的溶解和原生质体的存在提供一个优良的环境，防止原生质体的破裂，对原生质体具有稳定和保护作用[6]。研究不同渗透压稳定剂对原生质体形成数的影响，如图4所示，0.6mol/L NaCl作为渗透压稳定剂的原生质体形成数最多，达2.8×106个/mL。

图4 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响

原生质体在蒸馏水或低渗的环境中容易破裂，所以再生培养基必须是高渗的。分别以0.6mol/L的NaCl、MgSO4.7H2O、KCl和蔗糖配制再生培养基，计算再生率，发现以0.6mol/L的NaCl配制的再生培养基上原生质体再生效果最好。

2.2.6再生培养基的选择

培养基成分为菌株提供不同的营养条件和生长环境，Peberdy[7]等发现改变培养基成分可以获得不同的原生质体产量，真菌的再生培养基中常常补加酵母膏、蛋白质、糖类等作为营养因子。分别以0.6mol/L的NaCl配制PDA、PMA、查氏、马丁、酵母膏培养基作为再生培养基。结果发现培养基不同，其再生率有明显差异。本实验采用PDA作为原生质体的再生培养基，其再生率可达27%左右，效果最佳。

图5 不同培养基成分对原生质体再生的影响

3 结论

错综复杂的菌丝细胞的生理状态、去壁酶种类、浓度、作用时间都可能对原生质体的形成和再生产生影响。实验结果表明，米曲霉菌株F16原生质体制备和再生的最佳条件为：菌龄15小时，裂解液为含0.75%蜗牛酶、0.75%纤维素酶和0.5%溶菌酶的混合酶液，温度28℃、时间2.5h、0.6mol/LNaCl作为渗透压稳定剂，高渗PDA培养基为再生培养基。此条件下的原生质体形成量大，再生效果好。在具体实验操作中，还需要注意几点：一是排除再生培养基上的冷凝水，因为水分会降低渗透压导致原生质体破裂；二是制备好的原生质体不能保存太久，最好现制现用；三，在用血球计数板进行显微观察时，最好减弱外置光源的强度，因为投射光过强，原生质体与背景颜色反差较小[8]，不利于观察。

[1] 陈力力. 血粉发酵生产中的微生物[J].肉类工业,2003,(7):43.

[2] Emerson S , Emerson M.R1 Production, reproduction and reversion of protoplastlike st[J ].Proc Nal Acad Sci USA,1958, 44 :668 – 6711.

[3] Reddy C R K, Dipakkore S, Kumar G R, et al. An imp roved enzyme p reparation for rapid mass production of protoplasts as seed stock for aquaculture of macrophytic marine green algae [J]. Aquaculture, 2006, 260: 290-297.

[4] 宋庆涛,张国珍,董金皋. 玉米大斑病菌原生质体的制备和再生[J].微生物学通报, 2003,30 (2) : 41-44.

[5] 张志光.真菌原生质体技术[M ]. 北京: 湖南科学技术出版社,2003.

[6] 张志光,由媛,全丽等.双亲灭活的原生质体融合株啤酒酵母DR9­­­-2的构建及其特征的研究.酿酒，2007,34（5）:72-75.

[7] PEBERDY J F.In microbial and plant protoplasts [M].London:Academic Press,1976,39-50.

[8] 刘青,肖东光.一种观察酿酒酵母原生质体的简易方法[J].酿酒科技,2005,（6）:123-125.