发酵剂的筛选及其对搅拌型酸奶理化特性的影响

冯大伟，周家春，黄龙

(1.华东理工大学 食品科学与工程系，上海 200237；2.帝斯曼(中国)有限公司 食品创新中心，上海 210203)

发酵剂的筛选及其对搅拌型酸奶理化特性的影响

冯大伟1，周家春1，黄龙2

(1.华东理工大学 食品科学与工程系，上海 200237；2.帝斯曼(中国)有限公司 食品创新中心，上海 210203)

通过调查单菌株发酵特性、球菌/杆菌比例的选择、菌株复配后的性能，得到了4组优化的发酵剂配方。在不添加任何增稠剂的条件下，其发酵的酸奶在28 d货架期内质构、后酸化程度表现优异且稳定。此外，为了预测酸奶货架期后酸化程度的强弱，比较了15组28 d储存期实验与加速实验中所得的pH值及其变化趋势。结果表明，加速试验中趋于定值时的pH值可以作为判断后酸化程度强弱的先行指标。

发酵剂；酸奶；货架期；后酸化；质构

0 引 言

酸奶因其风味独特、营养价值高以及有益人体健康，倍受青睐。据报道，地中海周边地区成为世界三大疾病(心脑血管疾病、癌症、老年痴呆症)发病率最低的地区与居民喜食酸奶有关[1]。

发酵剂是指为制作发酵乳制品而调制的含乳酸菌的培养物[2]。目前国内大型乳品企业几乎全部使用直投式发酵剂(Directed Vat Set)发酵牛乳[3]。DSM公司是直投式发酵剂的主要生产商之一。

搅拌型酸奶在贮存过程中会出现乳清析出、风味不良、口感差和后酸化严重等问题[4]。酸奶发生后酸化(post acidification)，出现消费者不可接受的酸味，缩短了酸奶的货架期[5]。发酵剂的菌株特性与酸奶的理化特性有着密切关系。本研究主要针对后酸化及质构两大问题，使用DSM菌种，以期筛选出货架期内品质优良的酸奶用复合型发酵剂菌种。

1 材料与方法

1.1 主要材料

若悬河Y若悬河Y菌株：保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus，LB）3株，分别记作LB1，LB2，LB3；嗜热链球菌 （Streptococcus thermophilus,ST）6株， 分别记作ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6；复合型酸奶发酵剂STA（由不同确定的嗜热链球菌菌株混合而成）均由DSM食品配料部提供。接种量均为5 U/1000 L牛奶，其中U为DSM菌种含量使用单位。

原料为全脂奶粉（进口），白砂糖（食品级）；培养基为MRS琼脂（MERCK），M17琼脂（OXOID）；检测试剂为乙醛检测试剂盒。

1.2 主要设备

均质机，恒温水浴槽（高、中、低温）3台，pH计，发酵监控仪，黏度计，自动漩涡振荡混合器，高压灭菌器，生物安全柜，电子天平，恒温培养箱，厌氧罐，分光光度计。

1.3 酸奶的制作工艺

纯净水→预热至50～60℃→加质量分数为12%全脂奶粉，780 r/min搅拌15 min→质量分数为6%白砂糖混合15 min→升温至65℃均质 (20 MPa)→杀菌(95℃，5 min)→ 冷却至42～43℃接入发酵剂恒温发酵→pH值4.5以下结束发酵，恒温水浴冷却至20℃→100 r/min框式搅拌桨搅拌15 min→灌装至酸奶杯，4℃恒温冰箱冷藏及后熟→隔天检测。

1.4 检测方法

1.4.1 pH值

pH计用于酸奶发酵终点及储存期间pH值变化的检测。CINAC用于发酵期间pH值的全程监控。为了考察酸奶货架期后酸化程度，进行如下加速试验：pH值达到4.5后，样品结束发酵，而CINAC继续在43℃恒温水浴下，监控酸奶后续pH值变化直至pH值稳定（1 d左右）。记录发酵特征参数，分析发酵过程变化特征。

1.4.2 滴定酸度

按照GB/T 5009.46-2003提供的方法进行测定。具体方法：准确吸取10 mL试样于150 mL锥形瓶中，加20 mL经煮沸冷却后的水及数滴酚酞指示液，混匀，用氢氧化钠标准溶液 (本研究实际使用浓度为0.1016 mol/L)滴定至初现粉红色，并在0.5 min内不褪色，消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数乘以10即为酸度(°T)。

1.4.3 黏度

将酸奶样品从4℃冰箱取出，Brookfield DVII+Pro黏度计检测。检测条件为：S63转子，转子转速10 r/min，30 s后读数。

1.4.4 乙醛质量分数

在乙醛脱氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的作用下，乙醛定量氧化成乙酸，NAD被还原为NADH。通过紫外分光光度计在波长340 nm下测得的NADH生成量可求得乙醛质量分数。详细操作请见产品说明书(Acetaldehyde UV-method,Cat.No.0668613)。

1.4.5 活菌数

分别在发酵结束后1，7，14，21，28 d时取1.00 g酸奶样品，用无菌生理盐水逐级稀释至合适的倍数后，采用平板倾注法接种并倒置培养。

嗜热链球菌的选择性计数：M17琼脂培养基，有氧环境，37 ℃，24 h。

保加利亚乳杆菌的选择性计数：MRS琼脂培养基，厌氧环境，37 ℃，72 h。

1.4.6 感官评价

酸奶4℃冷藏1 d后进行感官评价。主要对酸奶的组织状态、滋味和气味进行评价。质构指标包括拉丝性、光滑度、黏聚性和稀稠度；滋味指标包括甜味、酸味、苦味、奶油味；气味指标包括奶油味、乙醛味。

酸奶的拉丝性指当用小勺舀起酸奶时，酸奶能够被拉断时的距离。特别是在酸奶采用产黏菌种时，可以比较不同菌种产生的效果；酸奶的粘聚性反映的是酸奶内部的聚结程度，在口腔表现为酸奶在舌头上扩散的速度；稀稠度反映的是酸奶流动的难易程度。

感官评价得分采用10分制，其中1代表该指标特征强度最弱，10代表特征强度最强。

2 结果与讨论

2.1 酸奶发酵剂的单菌株发酵特性

2.1.1 保加利亚乳杆菌的发酵特性

优良的酸奶发酵剂菌株必须具有较好的发酵特性。各单菌株的发酵特性往往决定了复配后的发酵表现。图1为保加利亚乳杆菌发酵特性曲线。

由图1可以看出，保加利亚乳杆菌发酵的酸奶pH值达到4.5以下所需时间基本在10 h左右。42～43℃发酵58 h后pH值基本达到稳定。LB3产酸速度最快，只需8.42 h就能使牛乳pH值达到4.5，但稳定时的pH值也比较低，pH值为3.47。LB1和LB2在发酵初期经历了不同程度的延滞期，因此相对于LB3，体系pH值达到4.5所用时间较长，同为12.58 h。23 h后，两条重合的发酵曲线分开，LB1产酸速度变快，最终pH值与LB3相同。LB2发酵的酸奶货架期后酸化加速试验的最终pH值为3.53，后酸化程度最弱。对发酵至pH值为4.5的酸奶隔天进行感官评价，使用LB2发酵的酸奶，奶香浓郁；而使用LB3发酵的酸奶，乙醛香味浓郁。

2.1.2 嗜热链球菌的发酵特性

由图2可以看出，ST2和ST3的发酵进程几乎一致，仅在发酵中期（2.0～4.5 h）有所不同。发酵至pH值为4.5所需时间最短的为ST6，仅需4.33 h，但其pH值稳定时的值也最低。总体来说，除了ST1，其余嗜热链球菌的发酵速度都比保加利亚乳杆菌的快。嗜热链球菌发酵的酸奶pH值稳定时的值普遍较高，都在pH值为3.9以上，而3株杆菌在pH值为3.5左右。这表明酸奶后酸化的程度是由保加利亚乳杆菌决定的。ST5的发酵周期较长，但是稳定时的pH值为4.17，后酸化程度较弱。ST1的发酵时间最长且发酵终点pH值为4.39，发酵初期出现pH值不降反升的现象，可能是由于该株菌代谢产物较为特殊，需经进一步的研究。ST4发酵的酸奶，奶香味浓郁。ST1发酵过程过长，发酵期间易被杂菌污染，发酵结束时酸奶已腐败变质。

2.2 酸奶发酵剂球杆菌比例与后酸化的关系

图3为货架期后酸化加速实验中TpH4.5，Tmax，pHmax，pHend随球菌用量变化结果。

表2 球菌杆菌复配后的发酵特性及酸奶黏度表现

由图3可以看出，单独由嗜热链球菌发酵，达到最大酸化速度时的pH值为5.53；单独由保加利亚乳杆菌发酵，达到最大酸化速度时的pH值为4.92。表明酸奶在发酵过程中，首先快速生长的是嗜热链球菌，当pH值从6.5下降到5.5时，保加利亚乳杆菌的生长开始加快，而嗜热链球菌的生长逐渐减慢，pH值下降到5.0左右时，保加利亚乳杆菌控制了酸奶的发酵[6]。随着发酵剂中嗜热链球菌比例的增加，发酵时间不断缩短。完全由嗜热链球菌发酵的酸奶，发酵时间只需260 min，表明酸奶发酵时间的长短并非由保加利亚乳杆菌起主导作用，这与赵征等[7]的研究结果相悖。

酸奶pH值不仅影响产品本身的口味，而且对产品的货架期有较大的影响。在酸奶发酵剂中调整保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例可使酸奶后酸化程度减弱[8]。考察货架期后酸化加速试验结果(图3)，随着发酵剂中保加利亚乳杆菌所占比例的下降，pH值稳定时的值越高，表明后酸化程度也越弱。郭清泉[9]研究表明，保加利亚乳杆菌是导致后酸化发生的主要发酵剂菌，其细胞壁或细胞膜的性质保护了杆菌的乳糖酶活性。酸奶在储存期中，保加利亚乳杆菌继续发酵乳糖，最终使pH值下降到3.5。

实验表明，当发酵剂中杆菌的比例较高时，发酵周期较长且酸奶的后酸化程度较严重，严重影响酸奶风味，货架期大大缩短。球菌含量较高时，结果则相反。但是考虑到酸奶的特有风味物质乙醛基本上是由杆菌产生的，因此最终确定后续试验的球菌杆菌用量比为0.8 U︰0.2 U。

2.3 酸奶发酵剂球菌杆菌复配配方的筛选

嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌以接种比例为0.8 U︰0.2 U，总接种量为5 U/1000 L牛奶接种发酵，所得结果如表2所示。

由表2可以看出，ST6与3株杆菌进行复配，发酵周期均为最短，只需255 min左右，故将其作为后续筛选实验的候选菌株。与ST6相反，ST1与各杆菌复配，由于发酵周期普遍偏长，故不适宜作为发酵剂菌种。ST5与LB3具有较为明显的弱后酸化现象，故也作为候选菌株。实验发现，ST5和ST6与各杆菌复配发酵后的酸奶，酸奶黏度偏低，在感官评价上表现为粘聚性小、粉状，质构有缺陷，因此试图通过在原有配方中添加产黏菌株改善其质构。一些乳酸菌能够产生胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)。胞外多糖是指菌株在其生长、代谢过程中分泌多糖于细胞外，形成荚膜多糖黏附于细胞表面，或以粘质多糖形式存在于细胞周边培养基中，其形成有利于改善产品的黏度和质构，防止酸奶凝胶破裂和乳清析出[10]。ST2，ST4，LB2是产胞外多糖菌株，能改善酸奶质构，且ST2和ST4用作酸奶发酵剂，发酵周期较短，后酸化程度较弱，因此也作为候选菌株进行后续筛选。

综上所述，选取6株单菌株再加上发酵剂STA以ST︰ST︰LB为0.4 U︰0.4 U︰0.2 U进行3株乳酸菌复配实验。 其中，ST5与ST6（非产黏菌株）、ST2与ST4（产黏菌株）由于质构特性相近故不必相互组合与杆菌复配。结果显示，实验各组酸奶发酵周期在260～310 min之间， 储存1 d后黏度在5.675～7.834 Pa·s之间，表明发酵时间适宜，黏度适中。货架期后酸化加速试验中pH值稳定时的pH值在3.85～4.02之间，而4℃恒温保存28 d后所测得的各组酸奶样品pH值在4.20～4.36之间。前者与后者比较，前者的pH值均低于后者，但各组加速试验和非加速试验之间的相关性较强，因此加速实验所得的结果作为判断货架期后酸化程度的指标是可行的。

对以上各组3株乳酸菌联合发酵所得酸奶的感官进行评价，优选出了4组，分别为：1#(ST4-ST5-LB3)，2#(ST4-ST5-LB2)，3#(ST4-ST6-LB2)，4#(STAST2-LB2)。筛选得到的4组酸奶与市场上最畅销的2款酸奶进行比较，如图4所示。由图4可以看出，1#、2#、3#样品更接近畅销2酸奶，4#样品在感官上更接近畅销1酸奶。

2.4 复合型发酵剂发酵的酸奶在货架期内理化特性

考察了经过筛选得到的4组酸奶在货架期内的各方面理化特性的变化。

2.4.1 酸奶的后酸化

酸奶后酸化现象导致的结果是酸奶无法长期贮存。通过之前改变嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的比例、筛选弱后酸化的菌株等措施来控制酸奶的后酸化程度是具有明显的效果的。图5为4组酸奶储存期内pH值与滴定酸度的变化。

由图5可以看出，储存期内随着酸奶pH值的降低，滴定酸度值逐渐增大。1#和2#在储存期内，pH值变化缓慢，保存28 d后pH值仍能达到4.3以上，滴定酸度在100°T左右，表明这两款酸奶后酸化程度非常弱，能够充分保证酸奶在货架期内口味保持稳定。4#产品在储存期内pH经历了两次下降及上升过程，7d之后的pH值变化范围在4.25～4.35之间，也能符合货架期内的品质稳定的要求。而pH变化最为显著的3#样品，储存期内的pH值均在4.2以上，滴定酸度在110°T以下，同样能满足口味要求。

2.4.2 酸奶的质构

在酸奶的加工与储藏过程中，如灌装过程、后酸化等，都会影响到酸奶的品质及质地，而其中较严重的表现为：蛋白沉淀、乳清析出、分层等，严重影响产品的可接受性。增稠剂的添加可改善酸奶的质地、防止乳清分离，但一些欧洲国家（如法国、荷兰）明令禁止普通酸奶中添加增稠剂。而通过提高乳的总固形物含量，可以改善质构，但同时又增加了成本。一些乳酸菌菌株能够产生胞外多糖(EPS)，这有助于改善酸奶的组织状态和黏稠度[11]。因此选择产黏菌株作为酸奶发酵剂已成为改善酸奶质构的优选方法。此次研究中，使用了ST2，ST4，LB2产胞外多糖菌株用于改善产品质构，储存期内均未发现乳清分离、分层等现象且酸奶表面光滑均一。

黏度是搅拌型酸奶生产过程中重要的控制项目之一，也是评价酸奶质量的重要指标。由图6可知，4款酸奶储存期内的黏度呈总体上升趋势。表明在储存期内，产黏菌株产生胞外多糖使得酸奶体系黏度增加，质构在经历搅拌、灌装后得到恢复且明显改善。3#相对于其他3款酸奶，黏度变化较弱，这可能是由于其储存后期pH值相对较低的缘故，还需作进一步的研究。

2.4.3 酸奶的风味

优质的酸奶必须具有良好的滋气味。乙醛为酸奶中的主要风味物质之一，测定其在发酵乳中的质量分数对评价产品风味意义重大。图7为4组酸奶储存期内乙醛质量分数的变化。

由图7可以看出，各款酸奶在储存期内乙醛质量分数的变化在8.03～16.2 μg/g之间，变化趋势不一，但是质量分数均高于7 μg/g[12]。2#和4#酸奶在保存21 d时乙醛质量分数较高，而1#和3#乙醛质量分数达到了最低。除了4#酸奶，其余3款酸奶在14 d后的乙醛质量分数均减少，这与Guzel-Seydim等[13]研究14 d后的酸奶乙醛质量分数减少的结果一致。

2.4.4 活菌数测定

评价酸奶品质，尤其是评估其生理机能时的一个重要指标就是产品中活性菌种的数量。而通过对酸奶中不同乳酸菌菌种选择性计数的研究可以更好地评估酸奶的品质与活菌数内在的联系。储藏期内，乳酸菌仍处于缓慢的生长代谢过程中，耐酸性较强的保加利亚乳杆菌会保持其发酵活性，使酸奶的酸度进一步升高。图8为4组酸奶储存期内嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌活菌数的变化。由图8可以看出，储存期内嗜热链球菌的活菌数呈下降趋势，但都能保持在108mL-1以上，1#与2#和3#与4#的变化趋势一致；保加利亚乳杆菌的活菌数变化1#与其他3组有所不同，表现为上升趋势，2#与4#表现相似。将活菌数变化结果与这4组配方中的菌株组成进行比较 （1#和2#用的球菌相同，2#、3#、4#用的杆菌相同），发现活菌数的变化与各菌株的自身生长特性相关。图9为4组酸奶储存期内球菌杆菌比例与pH值之间的相互关系。

由图9可以看出，储存1 d后，球菌/杆菌比例已达到100︰1以上。后酸化程度与球菌杆菌的比例有关，后酸化程度极弱的1#、2#、4#，其储存期后期球菌杆菌比例基本稳定在3个数量级上；而后酸化程度较弱的3#，其球菌杆菌比例基本稳定在2个数量级上。这进一步证明，改变球菌杆菌的比例能有效的控制后酸化程度，使酸奶的品质得到保证，具有更长的货架期。

3 结 论

酸奶的感官及理化特性与发酵剂各菌株的特性有着密切关系。本文使用DSM菌种库菌种，通过对酸奶发酵剂单菌株发酵特性的研究、球/杆菌比例的选择、2株乳酸菌复配、3株乳酸菌复配后各性能 （酸度、质构、感官）的研究，筛选出了4组发酵剂配方。随后，对其进行了28 d储存期内各理化特性的考察。对后酸化、质构、风味、活菌数的评价表明，在不添加任何增稠剂的条件下，其发酵的酸奶质构及后酸化程度表现优异且稳定。

为了预测酸奶货架期后酸化程度的强弱，采用了加速试验。杀菌后的牛奶接入菌种后，发酵监控仪在43℃恒温水浴下持续监控其pH值变化，直至pH值达到稳定（1 d左右）。通过对各组稳定时pH值大小的比较，可以筛选出后酸化程度较弱的菌种。对15组28 d储存期实验与加速实验所得的pH值结果进行比较，表明该值作为判断后酸化程度强弱的先行指标是可行且快速的。

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Effects of different starter culture blends on sensory,physico-chemical properties of stirred yoghurt

FENG Da-wei1,ZHOU Jia-chun1,HUANG Long2
(1.Department of Food Science and Technology,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.DSM Food Innovation Centre,DSM(China)Ltd.,Shanghai 210203,China)

The fermentation performance both of single strain and strain blends with different ratios ofStreptococcus thermophilus to Lactobacillus bulgaricusin milk were investigated.4 optimum compositions of strain blends were selected accordingly.The low level of post-acidification and improved texture of stabilizer-free yoghurt were found during the shelf life of 28 d by using these 4 selected culture blends.The strains with low acidification level were selected by Accelerated Shelf Life Testing as well.The storage temperature of yoghurt was set to be 43℃as same as the fermentation temperature and the pH of sample was observed till the pH approached a constant value.This method was proved to be more effective and efficient for forecasting the post-acidification level during shelf life compared with conventional evaluation test.

Starter culture;Yoghurt;Shelf life;Post-acidification;Texture

TS252.54

A

1001-2230（2010）03-0022-05

2009-12-10

冯大伟(1984-)，男，硕士研究生，主要研究方向为乳品科学。

黄龙