毒死蜱对大鼠生精细胞增殖细胞核抗原表达的影响

赵长瑶，吴焱森，吴 婧，周晓娟 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

毒死蜱对大鼠生精细胞增殖细胞核抗原表达的影响

赵长瑶，吴焱森，吴 婧，周晓娟 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

目的：探讨毒死蜱对大鼠睾丸生精细胞增殖及相关因素的影响。方法：SD大鼠30只随机分为3组，对照组、低剂量0.8mg/(kg·d)和高剂量8.0mg/(kg·d)染毒组，28d后观察大鼠体质量、睾丸脏器系数变化，采用免疫组化SP法检测睾丸生精细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果：低、高剂量染毒组体质量分别为(278.86±20.47)、(244.80±21.18)g，低于阴性对照组，差异有统计学意义(Plt;0.05)；生精细胞PCNA增殖指数PI分别为(22.66±2.59)%、(14.26±2.31)%，均低于阴性对照组，差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论：毒死蜱可降低生殖细胞PCNA的表达，对雄性生殖系统造成损害。

毒死蜱；生精细胞；增殖细胞核抗原

毒死蜱(chlorpyrifos，CPF)是一种杀虫谱广、低毒高效的有机磷农药，其全球销售额占有机磷农药第一位。近年来有机磷农药对环境和机体的危害日益引起人们的重视。美国国家癌症研究机构2004年报道CPF与肺癌的发生有关[1]。同时CPF作为一种可疑的环境内分泌干扰物，其内分泌干扰作用问题令人们十分关注。国内有研究表明CPF可以引起大鼠精子数目减少，精子活动度下降，精子畸形率增加等生精功能障碍[2]，但其确切的分子机制尚不明确。本实验通过研究一定剂量的CPF对大鼠生殖细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响，以探讨CPF对生精功能的影响，为进一步阐明CPF的雄性生殖毒性的可能机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物分组及染毒方法 30d龄健康雄性SD大鼠30只，体质量55～65g，长江大学医学院动物中心提供。

1.1.2试剂 毒死蜱原药(纯度99%，湖北沙隆达股份有限公司产品)；溶剂为市售精制玉米油；PCNA免疫组化试剂盒(北京中心生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组及染毒方法 霍恩氏法确定CPF对SD大鼠的LD50值。将大鼠随机平均分为3组，分别为(溶剂)对照组、CPF低浓度0.8mg/(kg·d)组、CPF高浓度8mg/(kg·d)组。所有动物均以玉米油作为溶剂，腹腔注射染毒，自由饮食，饲料中不含豆饼，染毒28d(2个生精周期)后处死。

1.2.2检测指标 ①大鼠体质量、睾丸称重并计算脏器系数。处死大鼠后剖腹暴露睾丸，分离系膜及周围脂肪，切除睾丸，立即称湿重并计算脏器系数。公式：脏器系数(%)=脏器湿重(g)/体质量(g)×100%。②称重后取大鼠一侧睾丸，常规方法固定、包埋、切片、脱蜡，3%的H2O2室温孵育15min，PBS清洗后热修复10min。正常山羊血清封闭，室温孵育10min，滴加1∶150稀释的PCNA单克隆抗体，4℃过夜。PBS清洗，滴加生物素标记的二抗孵育10min，辣根酶标记的链霉卵白素37℃孵育15min。PBS清洗，DAB显色，苏木精复染，透明，封片。阴性对照用PBS代替一抗。

1.3统计学处理每个睾丸组织随机选择10个垂直切面的生精小管，以细胞核内出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，分别计数PCNA表达阳性生精细胞数各占总生精细胞数的比例，即增殖指数(PI)。采用SPSS10.0软件进行方差分析。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1染毒对大鼠体质量、睾丸重量及其脏器系数的影响见表1。结果显示染毒组的大鼠体质量增长缓慢，染毒组的睾丸脏器系数与对照组相比较有统计学差异(Plt;0.05)，脏器系数呈上升趋势。

2.2染毒对大鼠PCNA表达的影响见表2。结果显示各组大鼠均可见PCNA阳性表达的生精细胞，主要见于精原细胞和精母细胞，圆形精子细胞少量表达，精子不表达。各染毒组生精细胞PI与对照组比较有统计学差异(Plt;0.05)，且PI值呈下降趋势。

表1 各组大鼠体重、睾丸重量及其脏器系数的比较

注：与对照组、低剂量组比较，＊Plt;0.05。

表2 各组大鼠生精细胞PCNA增殖指数的比较

注：与对照组、低剂量组比较，＊Plt;0.05。

3 讨 论

睾丸正常生精过程即从精原细胞到精子形成的连续增殖分化过程，包括精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成三个阶段。在此过程中，精子发生对外来有害因素的作用非常敏感，环境化学物可在不同阶段干扰精子的正常发生。本实验结果显示随CPF染毒剂量的增加，大鼠体质量增长减慢，且睾丸脏器系数与对照组比较显著升高，这与国内学者研究结果基本一致[2]。表明CPF对雄性生殖器官具有一定毒性作用，可能影响睾丸的正常精子发生过程。

PCNA基因表达是细胞DNA复制、细胞增殖的一个标志。PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，具有协同DNA前导链和后随链的合成，为DNA复制起始所必须，具有维持DNA多聚酶活性的作用。PCNA含量变化在细胞增殖中有明显周期性，与DNA合成密切相关[3]。本实验观察到PCNA在生精细胞核内表达，且主要见于精原细胞和精母细胞，而精子不表达。这是由于处于有丝分裂期的精原细胞和减数分裂期的精母细胞中有DNA合成，而精子已停止细胞分裂，无明显DNA合成。本研究结果显示CPF染毒时生精细胞的PCNA表达减弱，且随染毒浓度加大，PI值显著减低。

CPF对生殖细胞增殖能力的影响可能是一个多途径、多因素的过程。本实验研究结果表明CPF对雄性生殖器官产生毒性作用，可能是通过一定途径影响PCNA的表达，使生精细胞多聚酶活力下降，生殖细胞增殖能力下降，干扰精子的正常生长和发育过程，其具体分子机制还需进一步研究。

[1]lavanja MCR， Dosemeci M， Samanic C，etal.Pesticides and lung cancer risk in the agricultural health study cohort[J]. Am J Epidemiol， 2004， 160(9)：876-885.

[2]文一，魏帅，潘家荣. 毒死蜱对雄性大鼠生精功能的影响[J]. 农药，2008，47(8)：595-597.

[3]Chieffi P， Nastic M，Fulgione D，etal. Expression of PCNA in the testis of lizard，Podarcis sicula:an endogenous molecular marker of mitotic germinal epithelium proliferation[J]. Zygote，2001，9：317-320.

[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.04.036

R99

A

1673-1409(2009)04-R075-02

2009-11-02

赵长瑶(1973-)，女，湖北荆州人，讲师，从事医学基础教学与研究工作。