乳酸链球菌最适抑菌培养条件的研究

李真顺，姜 源

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

乳酸链球菌最适抑菌培养条件的研究

李真顺，姜 源

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

为降低天然防腐剂乳酸链球菌素(Nisin)的生产成本，以金黄色葡萄球菌为试验菌，探讨了直接利用乳酸链球菌(Lactococcuslactis)培养液进行抑菌的最适培养条件。首先通过单因素试验，初步确定了最适碳源、氮源、金属离子及其浓度或配比的范围，然后采用正交试验L9(33)优化后得到的乳酸链球菌抑菌的最佳发酵条件为：3.0 g/100 g葡萄糖，4 g/100 g蛋白胨，2 g/100 g酵母膏，1 g/100 g牛肉膏，0.005 mol/L MgSO4。优化后的培养基抑菌能力明显提高，此结果可为乳酸链球菌素的生产提供参考。

乳酸链球菌(Lactococcuslactis)；抑菌条件；营养要求

乳酸链球菌素(Nisin)能够抑制大部分革兰阳性菌及其芽孢的生长与繁殖， 特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显，是世界上公认的安全防腐剂。同化学防腐剂相比，乳酸链球菌素作为一种纯天然生物防腐剂具有许多优点，它安全无毒、抑菌菌谱范围广。虽然从开发到使用已有50年的历史[1]，但是仍未广泛使用。制约Nisin应用的主要因素有2个，一是生产成本太高,二是纯品提取困难。目前Nisin发酵所用的培养基有机氮含量都比较高,这一方面增加了生产成本,另一方面由于培养基中含有较高浓度的多肽,影响了Nisin的分离提纯[2]。

乳酸链球菌(Lactococcuslactis)为一种安全无毒的微生物，它可产生Nisin，因此可直接利用其培养液进行抑菌而免去提纯的工艺，在食品工业上可直接作为发酵菌株进行生产。本研究以抑菌特性作为指标，探讨了获取其对金黄色葡萄球菌最佳抑菌特性的培养条件，以期为直接利用乳酸链球菌作为防腐发酵菌株应用到发酵食品中提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：冻干的乳酸链球菌10193来源于中国菌种保藏中心；脱脂乳粉为市场上购得的完达山牌脱脂乳粉；金黄色葡萄球菌长江大学生命科学学院微生物实验室分离保存。

试剂：蔗糖、葡萄糖、乳糖、Na2HPO4·12H2O、NaCl、MgSO4、KH2PO4、NaOH、无菌水均为分析纯；可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、琼脂、吐温 80均为食用级原料。

1.2 试验方法

(1)培养基制作 试验所用培养基配方分别如下：

CM1培养基：蔗糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO410 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO40.2 g/L，pH 6.8。

检测培养基：蛋白胨8 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、NaCl 5 g/L、Na2HPO4·12H2O 2 g/L、吐温80 10 mL，pH值6.8。

活化培养基(乳酸链球菌10193) ：脱脂乳12 g/100 g、葡萄0.5 g/100 g、酵母膏0.5 g/100 g。

活化培养基(金黄色葡萄球菌)：牛肉膏蛋白胨培养基[3]。

(2)发酵液预处理 用移液管移取1%乳酸链球菌10193于100 mL CM1培养基中,30 ℃ 150 r/min摇床下培养24 h左右。培养完毕后以体积百分数为10%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，30 ℃静置培养24 h，定时取样,检测样液D620 nm值及pH。

将培养一定时间的乳酸链球菌10193发酵液，5 400 r/min离心12 min，除去沉淀，收集上清液，并以滤纸片法[4]测乳酸链球菌10193的抑菌圈平均直径。

(3)抑菌试验方法 采用滤纸片法。抑菌培养条件为30 ℃ 24 h。

(4)乳酸链球菌10193培养基优化的单因素试验 以检测培养基为基础，以碳源、氮源、金属离子、培养温度为考察对象，10%的接种量进行单因素试验，发酵24 h后，测定其抑菌圈直径和光密度D620 nm，从而确定各因素最佳条件，具体如下：①碳源种类对试验菌株生长量的影响试验。以蔗糖、可溶性淀粉、乳糖分别代替检测培养基中的葡萄糖，添加量分别为1.5 g/100 g。②氮源种类对试验菌株生长量的影响试验。按3.0 g/100 g的比例分别在检测培养基中加入蛋白胨、混合氮源(酵母膏∶蛋白胨∶牛肉膏=1∶1∶1)、酵母膏、牛肉膏、柠檬酸三氨等5种氮源。③温度对菌株发酵液抑菌效果的影响试验。培养温度设为25 、30、32、35、37 ℃。④金属离子种类对试验菌株生长量的影响试验。检测培养基中分别添加0.001 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Cu2+。

(5)正交试验 在单因素试验的基础上，以抑菌圈直径为主要指标，选择碳源、氮源和金属离子为影响因素，确定各正交因子的水平，设计正交试验L9(33)，确定出最佳提取条件。其优化培养的工艺参数如表1所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 温度对菌株发酵液抑菌效果的影响

图1 温度对菌株抑菌效果和生长量的影响Figure 1 Influence of temperature on bacteriostatic effects and growth

不同温度对金黄色葡萄球菌抑菌效果的影响见图1。由图1可以看出，当温度为30 ℃时，抑菌效果较好，并且菌数也最多。随着温度的升高，乳酸链球菌菌数逐渐降低，抑菌圈直径也平稳降低，这说明30 ℃为乳酸链球菌10193的最适生长温度，而且菌数越多，抑菌效果越好。

2.2 碳源对菌株发酵液抑菌效果的影响

以不同碳源代替检测培养基中的葡萄糖，确定不同种类碳源对乳酸链球菌的生长及抑菌特性的影响，结果见图2。由图2可知，以葡萄糖作为碳源时乳酸链球菌10193生长量最大，而以蔗糖作为碳源时，其Nisin抑菌效果最好，而可溶性淀粉作为碳源时乳酸链球菌10193的生长量和抑菌效果均差。因此选择葡萄糖为最佳碳源。

图2 碳源对试验菌株抑菌效果和生长量的影响Figure2 Influenceofcarbonsourceonbacteriostaticeffectsandgrowth图3 氮源对菌株抑菌效果和生长量的影响Figure3 Influenceofnitrogensourceonbacteriostaticeffectsandgrowth

图4 金属离子对菌株抑菌效果和生长量的影响Figure 4 Influence of metal ions on bacteriostatic effects and growth

2.3氮源对菌株发酵液抑菌效果的影响

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

不同氮源对菌株发酵液抑菌效果的影响结果见图3。由图3可以看出，以混合氮源作为氮源时细胞生长量和抑菌效果最好，牛肉膏则相对影响最小，而当柠檬酸三铵作为氮源时乳酸链球菌10193几乎不生长。5种氮源抑菌效果的次序为：混合氮源gt;酵母膏gt;蛋白胨gt;牛肉膏gt;柠檬酸三铵。综合考虑，选择混合氮源作为乳酸链球菌10193细胞生长和抑菌的最佳氮源。

2.4 金属离子对菌株发酵液抑菌效果的影响

金属离子对菌株发酵液抑菌效果的影响结果见图4。由图4可见，6种金属离子产Nisin的抑菌效果的次序为：Mg2+gt;Zn2+gt;K+gt;Ba2+gt;Ca2+gt; Cu2+，而细胞生长量在不同金属离子之间的变化趋势与抑菌效果趋势大致相同。而以Mg2+作为金属离子加入培养基时，较之其它金属离子相比，其菌株生长量也达到最大，综合考虑，确定Mg2+为最适金属离子。

2.5 正交试验结果

采用正交试验L9(33)对不同碳源、氮源和金属离子浓度下产Nisin最佳条件进行优化，试验结果见表2。由表2可知，3个因素的极差大小顺序为：硫酸镁浓度gt;混合氮源浓度配比gt;葡萄糖浓度，可见金属离子浓度是影响Nisin产生和产量的主要因子，其次是混合氮源浓度和葡萄糖浓度。最优的营养条件组合为A2B2C3。

3 小结

通过单因素试验，确定了最适碳源、氮源、金属离子及其浓度或配比，分别为2.5 g/100 g葡萄糖，1 g/100 g蛋白胨+1 g/100 g酵母膏+1 g/100 g牛肉膏、0.003 mol/LMg2+。采用正交试验优化后得到的乳酸链球菌10193抑菌性最佳的营养条件为：3.0 g/100 g葡萄糖、4 g/100 g蛋白胨、2 g/100 g酵母膏、1 g/100 g牛肉膏、0.005 mol/L MgSO4。

在试验过程中还进行了酸度的测定，结果表明，产酸能力越强抑菌效果越好，乳酸链球菌10193产酸能力对抑菌效果有直接影响。

本研究可为应用乳酸链球菌10193进行工业化生产Nisin提供必要的参数指标，为今后进行微生物型食品防腐剂的研究提供基础。

[1]缪存影.天然食品防腐剂—乳酸链球菌素[J].中国食物与营养，2008，(4):30～32.

[2]焦中高，陈海昌，刘 茵.营养因素对乳酸乳球菌DL-203生长及其Nisin生物合成的影响[J]. 食品工业科技，2003，(11): 22～24.

[3]欧阳谅. 微生物学实验法[M].南昌：江西人民出版社，1980.14

[4]赵 斌,何绍红.微生物学实验[M].北京：科学出版社,2004.38～40.

2009-08-31

李真顺(1978-)，女，湖北荆州人，工学硕士，讲师，主要从事畜产品加工研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.019

TQ920.1

A

1673-1409(2009)04-S065-03