脂蛋白脂酶基因缺陷小鼠急性胰腺炎的研究

赵严 程礼 王兴鹏 王宇辉 刘国庆

·论著·

脂蛋白脂酶基因缺陷小鼠急性胰腺炎的研究

赵严 程礼 王兴鹏 王宇辉 刘国庆

目的探讨应用脂蛋白脂酶基因(LPL)缺陷的杂合子小鼠作为制备高脂血症相关性急性胰腺炎的动物模型的可行性。方法野生型及LPL杂合子小鼠均分为实验组和对照组，每组又分为12、24 h 2个时点。实验组腹腔注射雨蛙肽(50 μg/kg体重)7次，每次间隔1 h。对照组同法注射等量生理盐水。检测各组小鼠血浆三酰甘油(TG)、淀粉酶水平，观察胰腺形态学改变并评分。结果LPL杂合子小鼠对照组血TG为(3.55±0.27)mmol/L，显著高于野生型小鼠对照组的(0.94±0.18)mmol/L(Plt;0.05)。杂合子小鼠实验组12 h的血TG、淀粉酶水平分别为(3.55±0.27)mmol/L和(3685±484)U/L，均显著高于野生型小鼠实验组12 h的(0.92±0.11)mmol/L和(2501±410)U/L(Plt;0.05)。杂合子小鼠实验组12 h的胰腺水肿、坏死、出血和炎细胞浸润的分值分别为3.94±0.21、3.94±0.21、1.84±0.25和1.84±0.25，均显著高于野生型小鼠实验组12 h的3.06±0.01、2.52±0.51、0.46±0.22和0.58±0.38(Plt;0.05)。结论LPL杂合子小鼠血TG中度升高且稳定，在雨蛙肽诱导下产生严重的急性胰腺炎，是研究高脂血症相关性急性胰腺炎发病机制的一种理想的动物模型。

胰腺炎； 高酯血症； 脂蛋白酯酶； 杂合子

高脂血症相关性急性胰腺炎(LAP)是一种病死率较高的疾病，且复发率高，并发症多，其发病机制未完全清楚。为阐明相关的发病机制，常用高脂食饵饲喂方法制备动物模型，但喂养周期长、动物个体差异易导致模型组血脂水平参差不齐等缺点。本文采用脂蛋白脂酶基因(LPL)缺陷的杂合子小鼠腹腔分次注射雨蛙肽方法制备高脂血症相关性急性胰腺炎模型，并探讨这种新模型形成机制。

材料与方法

一、实验材料及分组

选用北京大学医学部心血管研究所提供的4个月龄、雌性、脂蛋白脂酶(LPL)缺陷的杂合子C57BL6小鼠26只和野生型C57BL6小鼠28只，均分为实验组和对照组，每组又分为12、24 h 2个时间点。实验组腹腔注射雨蛙肽50 μg/kg体重，间隔1 h重复注射，共注射7次。对照组同法注射等量生理盐水。距首次给药12、24 h分别于眶静脉取血，肝素抗凝，离心，取血浆待测。留取胰腺组织标本， 10%甲醛溶液固定。

二、检测指标

1．血三酰甘油(TG)及淀粉酶检测：均采用北京中生北控生物技术有限公司提供的ELASA检测试剂盒，按照试剂盒说明书操作。

2．组织学检查：固定的胰腺组织常规脱水、包埋、切片、HE染色，由病理科医师阅片。参照Schmidt等[1]方法，即从水肿、炎细胞浸润、实质出血、实质坏死、空泡形成等方面进行双盲评分。

三、统计学处理

结 果

一、血清TG、淀粉酶水平变化

LPL杂合子实验组12、24 h的血TG 水平分别为(3.55±0.27)mmol/L和(3.56±0.32)mmol/L，对照组分别为(3.55±0.27)mmol/L和(3.55±0.27)mmol/L；野生型实验组12、24 h的血TG水平分别为(0.92±0.11)mmol/L和(0.92±0.07)mmol/L，对照组为(0.94±0.18)mmol/L和(0.88±0.15)mmol/L。杂合子实验组及对照组均显著高于野生型实验组及对照组(Plt;0.05)。

LPL杂合子实验组12、24 h的血淀粉酶水平分别为(3685±484)U/L和(3019±643)U/L，对照组分别为(471±23)U/L和(550±93)U/L；野生型实验组12、24 h的血淀粉酶水平分别为(2501±410)U/L和(2091±701)U/L，对照组为(358±43)U/L和(386±37)U/L。2个对照组之间无显著差异；2个实验组均显著高于其相应的对照组(Plt;0.05)；杂合子实验组显著高于野生型小鼠实验组(Plt;0.05)。

二、胰腺病理改变

野生型小鼠对照组的胰腺小叶排列整齐，结构完整(图1A)；实验组小鼠胰腺组织明显水肿，叶间隔、小叶间隔及腺泡间隔增宽，腺泡细胞点状坏死(图1B)。杂合子小鼠对照组的胰腺部分细胞内出现空泡变性、坏死(图1C)；实验组胰腺组织间质明显水肿，叶间隔、小叶间隔及腺泡间隔增宽，腺泡细胞空泡样变性、片状坏死，伴血管充血、血管周围及间质内炎症细胞浸润 (图1D)。杂合子小鼠对照组胰腺细胞坏死较野生型小鼠对照组明显；杂合子小鼠实验组胰腺的水肿、坏死、出血及炎细胞浸润均较野生型小鼠实验组显著(表1，Plt;0.05)。

图1野生型小鼠对照组(A)、实验组24 h(B)和杂合子小鼠对照组(C)、实验组24 h(D)的胰腺病理改变(HE ×200)

表1 各组胰腺组织病理评分

注：与野生型小鼠同组别、同时点比较，aPlt;0.05

讨 论

近年来，高三酰甘油血症已成为急性胰腺炎的发病原因之一[2]，其发病机制尚不清楚。而此研究的关键首先是建立合理的动物模型。

高脂血症动物模型主要有先天性、化学物质诱导和转基因动物3种[3]。由于先天性动物模型来源困难、价格昂贵,实际应用受到限制。化学物质诱导动物模型包括静脉或腹腔注射化学试剂和采用高脂饲料喂养或通过在食物中加入能促进肝脏合成胆固醇或三酰甘油的物质形成高脂动物模型[4-5]。Takahashi等[6]经股静脉注射Triton WR 1339诱导SD大鼠高TG血症。TritoWR1339是一种表面活性剂，它可以抑制卵磷脂胆固醇酰基转移酶，影响脂蛋白之间的脂质交换和形成脂蛋白复合物，抑制脂质在血液中的清除[7]，使血脂升高。此法简便、快速，但是不符合人类高脂血症的形成过程。喂养法形成的高脂动物模型，由于大鼠和小鼠对此类饮食敏感性差，且血浆脂蛋白的合成及清除率与人差异较大，导致模型组血脂水平参差不齐，且喂养时间长，所以很难作为理想的高脂血症模型。转基因动物模型通过不表达或过量表达基因来表现各种疾病。涉及脂质代谢的蛋白包括相应的受体、载脂蛋白(Apo)、与脂质代谢有关的酶和转运蛋白[8]。

北京大学心血管研究所鲍红梅等[9]与加拿大的合作者一起成功建立了LPL基因敲除C57BL6小鼠。LPL纯合子雄性小鼠由于体内缺乏LPL，出生后48 h内即全部死亡。因此，LPL纯合子仔鼠于出生12 h内必须用体细胞基因转移LPL才能成活,该鼠生长至成年表现为极度高的血三酰甘油和自发性胰腺炎，与人类LPL缺陷一致。

本实验采用该小鼠与野生型C57BL6小鼠交配后得到的杂合子鼠,具有稳定的中度高脂血症。本组实验小鼠的血TG为(3.55±0.27)mmol/L，显著高于野生型小鼠的(0.94±0.18)mmol/L(Plt;0.05)。实验结果显示，在相同剂量的雨蛙肽诱导下，LPL杂合子小鼠血淀粉酶水平及胰腺的水肿、坏死、出血、炎细胞浸润均显著高于野生型小鼠(Plt;0.05)，发生更严重的急性胰腺炎。提示在相同致病因素影响下，LPL杂合子小鼠更易发生胰腺炎或病变程度加重，可见高TG血症是促进胰腺炎发展和增加易感性的因素，而LPL杂合子小鼠也是一个理想的动物模型。

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2008-11-06)

(本文编辑：屠振兴)

Acutepancreatitisinmicewithlipoproteinlipasedeficiency

ZHAO Yan, CHENG Li, WANG Xing-peng, WANG Yu-hui, LIU Guo-qing.

Department of Gastroenterology, Shanghai First People′s Hospital, Medical School, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China

ObjectiveTo establish an experimental animal model of hypertriglyceridemic (HTG) pancreatitis by using special lipoprotein lipase (LPL) deficient HTG heterozygous mice.MethodsLPL deficient HTG heterozygous mice and wild type mice were divided into experiment group and control group, then each group was subdivided into 12 h,24 h subgroup. Acute pancreatitis (AP) was induced by caerulein intra-abdominal injection for 7 times (50 μg/kg) at the interval of 1 h; the mice in the control group

same amount of normal saline. The serum level of TG, amylase was determined, and morphologic changes were scored.ResultsThe serum level of TG in LPL deficient HTG heterozygous mice was (3.55±0.27)mmol/L, which was significantly higher than that of wild type mice [(0.94±0.18) mmol/L,Plt;0.05]. The serum level of TG and amylase in heterozygous mice at 12 h was (3.55±0.27)mmol/L and (3685±484)U/L, which was significantly higher than those in wild type mice [(0.92±0.11)mmol/L and (2501±410)U/L,Plt;0.05]. The pancreatic tissue edema, necrosis, bleeding and inflammatory cell infiltration score was 3.94±0.21, 3.94±0.21, 1.84±0.25 and 1.84±0.25 in heterozygous mice, which was significantly higher than that of wild type mice (3.06±0.01, 2.52±0.51, 0.46±0.22 and 0.58±0.38,Plt;0.05).ConclusionsThe serum level of TG was moderately and stably elevated in heterozygous mice. The mice developed more severe pancreatitis after caerulein induction, which was an ideal experimental model for study of mechanism of HTG pancreatitis．

Pancreatitis; Hypertriglyceridemia； Lipeprotein lipase； Heterozygote

CorrespongdingauthorWANGXing-peng,Emailwangxp1965@yahoo.com;LIUGuo-qing,Emailgeorgeliu@bjmu．edu．ca

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.017

200080 上海，上海交通大学医学院附属第一人民医院消化科(赵严、程礼、王兴鹏)；上海同济大学附属第十医院(王兴鹏);北京大学医学部心血管研究所(王宇辉、刘国庆)

王兴鹏，Email:wangxp1965@yahoo.com；刘国庆，Email：georgeliu@bjmu．edu．ca