解读“基因表达载体”

刘向华

高中生物人教版新课标教材《选修3·现代生物科技专题》中的“基因表达载体的构建”，是基因工程的基本操作程序中的第二步，也是基因工程的核心。

基因表达载体由目的基因(插入基因)、启动子、终止子、标记基因(抗生素基因)等组成。教师要引导学生认识：启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端；终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段；抗生素基因作为其标记基因。

基因表达载体构建的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用；启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，通过翻译过程，最终获得所需要的蛋白质；终止子使转录在所需要的地方停止下来；标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

1基因表达载体中的启动子、终止子是目的基因带有的，还是质粒上固有的

将供体生物的基因转移到受体生物的细胞中，只有使用生物自身基因的启动子、终止子才能比较利于基因的表达。如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒的目的基因前接上特定的启动子、终止子，目的基因中已含有启动子、终止子；如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的，只将基因的编码序列导入受体生物中。目的基因中没有启动子、终止子，是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，由于质粒上不含有目的基因的启动子、终止子，所以需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。

2标记基因是质粒上固有的，还是后加上去的

目的基因是否导入受体生物中还需要有标记基因作为筛选标记。一般情况下，质粒载体在基因组中有1—2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。由于构建载体的目的不同，需要的标记基因也不同，有的标记基因是质粒上固有的，有的标记基因是需要另外加上的，例如有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因(或做成目的基因与标识基因的融合基因)，如绿色荧光蛋白基因等。

3相关训练

图1为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EeoRI、BamHI的酶切位点，ampr为青霉索抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，orj为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。

(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有

、

、

3种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行

(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是

。

(3)目的莲因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是

，其合成的产物是

。

(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是

。

解析：基因工程中，一个重要的工具是限制性内切酶，因为肉眼看不见，所以学生理解起来有很大难度。应通过课本中的典型图解分析，帮助学生理解。

由基因操作的基本步骤可知，对于运载体——质粒，用限制酶切割一次，形成2个黏性末端，断开了两个化学键；目的基因从原来的DNA分子上被切下来，形成了2个黏性末端，但需断裂4个化学键。如果目的基因和质粒用同一种限制性内切酶来切割，则产生的黏性末端相同，这样用DNA连接酶连接时，就会产生三种产物：目的基因——目的基因、质粒——质粒、目的基因——质粒。

变通来想，要想只得到目的基因——质粒这种产物，应让二者两端的黏性末端完全不同，则只有一种连接方式，则此时应用2种不同的酶来分别切割目的基因的两端。

参考答案：(1)目的基因——载体连接物

载体——载体连接物目的基因——目的基因连接物分离纯化

(2)载体——载体连接物

目的基因——载体连接物载体——载体连接物

(3)启动子mRNA

(4)EcoRI和BamHI