高效液相色谱法测定血液和盆腔液及直肠组织中氟尿嘧啶浓度

袁　斌　杜　江　王崇树　张　翔　周春阳　雷　军

[摘要] 目的：建立测定血液、盆腔液和直肠组织中氟尿嘧啶浓度的高效液相色谱方法。方法：采用phenomenex geminiC18 110A色谱柱，以0.5 mol/L磷酸二氢钾溶液∶乙腈(99∶1)为流动相，检测波长为254 nm。样品处理采用30%三氯乙酸沉淀内源性杂质。结果：各组织标准方程线形r值均大于0.999，方法回收率在80.66%～89.73%。结论：本法操作简单, 重现性好, 可用于多种组织中氟尿嘧啶的含量测定。

[关键词] 直肠组织；药物浓度；氟尿嘧啶；高效液相色谱法

[中图分类号]R979.1[文献标识码]B [文章编号]1674-4721（2009）05（a）-119-02

Determination of 5-flourouracil concentration in serum，peritoneal fluid and rectum tissue by HPLC

YUAN Bin1, DU Jiang2, WANG Chongshu2,ZHANG Xiang1, ZHOU Chunyang1, LEI Jun1

(1.Institute ofMateria Medica ，North Sichuan Medical College, Nanchong 637000,China; 2. The Hospital Affiliated North Sichuan Medical College Nanchong 637000,China）

[Abstract] Objective：To determine flourouracil concentration in serum，peritoneal fluid and rectum tissue by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods：Phenomenex geminiC18 110Acolumn was used. The mobile phase was 0.5 mol/Lpotassium dihydrogen phosphate buffer:acetonitrile (99∶1). The detection wavelength was 254 nm.Tissues were treated with trichloroacetic acid to precipitate impurities. Results:The Rvalues of calibration curves in every tissue were larger than 0.9990, the recovery of method was between 80.66%～89.73%. Conclusion:The method is simple and reproducible. It is suitable for concentration determination of flourouracil in various tissues.

[Key words] Rectum tissue；Drug concentration；Flouroracil；HPLC

氟尿嘧啶(Fu)是临床常用的抗肿瘤药物,对组织肿瘤如直肠癌、胃癌、肝癌等有显著疗效。直肠癌是发病率较高的恶性肿瘤。万德森等[1]研究表明，肠腔化疗可使局部静脉血液内抗癌药在短时间内达到高浓度，但对癌旁组织，盆腔液和门静脉药物浓度未予测定。本研究建立了可同时用于测定血液、盆腔液和直肠癌组织中Fu浓度的高效液相色谱方法, 为该药在机体内的吸收和分布动力学研究提供简便、准确的测定方法。

1 仪器与试剂

色谱仪：waters 600E泵，waters 2487检测器；色谱工作站：CHROMSTATION 200 0色谱工作站软件；FU对照

品：美国Fluka公司产品；三氯乙酸为分析纯：天津福晨化学试剂厂；磷酸二氢钾为分析纯：成都化学试剂厂；乙腈：美国Dikma公司，色谱纯。血液与组织样本为本院附属医院提供。

2方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱为phenomenex geminiC18110A（250×4.6 mm,5 μm），流动相为0.5 mol/L磷酸二氢钾溶液：乙腈(99∶1)，流速1 ml／min，柱温30℃ ，紫外检测波长254 nm。

在该色谱条件下, 各空白样本的内源性物质对FU的测定无干扰, 药物峰与杂质峰分离好，FU保留时间约为7min，色谱柱的理论塔板数为15 000，见图1~4。取FU配制成一系列低浓度的各组织样本，在信噪比S/N＞3的条件下，能够测定出样本中药物的最低浓度分别为血浆0.025 μg／ml，盆腔液0.035 μg／ml，组织匀浆液0.035 μg／ml。

2．2样本的处理与测定

参考文献[2]，将待测血液、盆腔液分别离心5 min(3 000 rpm)，吸取0.5 ml上清液备用；精称直肠组织0.5 g，加入3 ml生理盐水于组织匀浆机上捣碎2 min，补足生理盐水定容至5 ml，振荡2 min后离心5 min(3 000 rpm)，吸取0.5 ml上清液备用。将处理后的样本加入0.1 ml 30 %三氯乙酸沉淀蛋白，振荡1 min，离心15 min(4 000 rpm)取出，取上清液80 μl进样，记下出峰后积分的峰面积。将峰面积代入回归方程，计算出药物浓度。

2．3 标准曲线制备

精称Fu 30 mg，置50 ml量瓶中，甲醇溶解定容。取该溶液1 ml，40℃氮气吹干，加入空白样本(血清、盆腔液或直肠组织匀浆液)2.5 ml溶解，即得240 μg／ml的母液。再由此母液分别配成120、60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 75、0.234 375 μg／ml系列浓度的标准液。将每一份标准液分别加0.1 ml 30%三氯乙酸，振荡1 min，离心15 min(4000 rpm)得上清液，取上清液80 μl进样，记下出峰后积分的峰面积，并计算出标准曲线，以药物浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，用直线回归推导出回归方程。血清：Y=6 671．93X+599．43（r=0．999 9）。盆腔液：Y=7 088．05X-1 478．66（r=0．999 9）。直肠组织匀浆液：Y=6 964．13X-3 561．41（r=0．999 5）。

2．4 回收率和精密度

配制高(120 μg／ml)、中(7.5 μg／ml)、低(0.468 75 μg／ml)3种浓度的样本和水溶液，直接进样。以样本的峰面积比水溶液样本的峰面积，得回收率。样本经处理后进样，测定日内误差(n=5)和日间误差(n=5)，结果见表1。

3 讨论

冯婉玉等[3]曾采用水-甲醇-冰醋酸(96.95∶3.0∶0.05, pH=3.5 )作为人血浆中氟尿嘧啶浓度测定的流动相，黄小梅等[4]则使用甲醇-0.3%乙酸溶液（2∶98）作为流动相，笔者考察甲醇-水(35∶65)、乙腈-甲醇-1％冰醋酸(5∶24∶71)等流动相[5]，结果发现流动相0.5 M/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(99∶1)的体系时，FU与杂质峰的分离效果最好，峰形也较对称。

血液、盆腔液及直肠组织成分复杂，内源性杂质丰富，Jung等[5]报道采用高氯酸作生物样品预处理沉淀剂,但本试验考察了高氯酸,发现其处理患者血浆时，FU峰处有干扰峰；作者也用甲醇沉淀法对组织进行了处理,进样发现,组织样品含有的极性杂质较多,即使增加甲醇与血浆体积的倍数,也无法将组织中的杂质沉淀干净[6-8]。而用30%三氯乙酸作沉淀剂时没有干扰峰,杂质沉淀效果较好。

由提取回收率及日内、日间精密度的结果表明,本法简便灵敏、专属性强, 生物样本中内源性杂质对FU测定不产生干扰,可用于生物样本中该药含量的测定。

[参考文献]

[1]万德森，李国材，张亚奇，等．肠腔灌注5-Fu后肠系膜静脉和周围静脉血药浓度测定[J]．癌症，1990，9：189-191.

[2]杜江，王崇树，张才全，等．直肠癌术中区域化疗和肠腔化疗血液和盆腔液及组织5-Fu浓度比较[J].第四军医大学学报，2007，28（24）：2278-2280.

[3]冯婉玉，蔡爽，申建伟．高效液相色谱法测定人血浆中氟尿嘧啶浓度[J]．中国药学杂志，2003，38（4）：982-983.

[4]黄雪梅，卢晓宁，路玫．高效液相色谱法测定氟尿嘧啶在人体内的血药浓度[J]．中国药师，2002，5（6）：345-346.

[5]Jung M, Berger G. Simultaneous determination of 5-fluorouracil and its active metabolites in serum and tissue by HPLC[J].J Chrom B,1997,702:193.

[6]陈碧．HPLC法测定人血清中5-氟尿嘧啶浓度[J]．药学进展，2005，29（7）：332-334.

[7]王涛，甄海青，王观春 ．高效液相色谱法测定大鼠子宫组织中氟尿嘧啶的浓度[J]．中国现代医药杂志，2007，9（2）：32-34.

[8]杜文力,李勇,王明霞，等．高效液相色谱法测定胃癌及癌周组织中的氟尿嘧啶[J].中国医院药学杂志，2005，25（8）：702-704.

（收稿日期：2009-03-27）