PCR法测定转基因ぶ参锸称芳安艏偈称费芯

刘峥颢 王庭欣 匡林鹤 吴广臣

摘要:通过对我国目前食品行业中的问题以及对PCR法测定转基因植物食品以及检测掺假食品的研究现状的分析,提出我国目前食品质量监督部门应推广采用已成熟的基因检测技术,用于食品质量检测,打击假冒伪劣产品,维护消费者利益。

关键词:PCR法;转基因植物食品;掺假;食品质量监督

中图分类号:R155.5

文献标识码:A

文章编号:16723198(2009)20029102お

1我国目前食品行业中的问题

植物基因工程如果从上世纪70年代处建立重组DNA技术开始,已有30多年的历史,目前世界上转基因植物多达一百多个物种,有近千例转基因植物被批准进入田间试验,其中有许多转基因产品已经通过商业开发进入国际市场。近年来,我国粮食呈净进口格局,2004年-2006年3年累计净进口1450亿斤,平均每年净进口500亿斤,其中就有相当部分含有转基因成分。转基因的高生产力、高品质性和高抗逆性,是传统品种无法比拟的,在人口、环境的压力下,转基因产品仍将具有较大的市场空间。由转基因食品市场化引发的安全问题也越来越成为人们关注的焦点。

同时,伴随着我国食品工业的飞速发展,不法分子的掺假方式越来越多、范围越来越广、内容越来越复杂。掺假的方式包括掺兑、混入、抽取、假冒、粉饰等手段。掺假范围可涉及粮油、肉类和加工制品、乳制品、果蔬、糖及糖制品、饮料类等各领域。掺假的例子不胜枚举。

粮食中常见的掺假为新米掺入陈米、廉价的米混入价高的米、面粉中混入滑石粉等。据检查发现食用植物油中花生油和芝麻油的掺杂、掺假尤为严重。食用植物油中可能会掺兑地沟油以及其他非食用油(如桐油、青油、蓖麻油、巴豆油、矿物油等),出售牟取非法暴利,严重影响了消费者的健康。掺假香油主要是掺兑水、冬瓜汤、米汤、猪油、棉籽油、菜籽油或其他的油等,有的香油是由色拉油与香油精勾兑的。掺假麻酱是用炒过的莜面粉再加上色拉油配制而成的。尤以私营企业及地方小油料加工厂的散装粮油以及小的粮油店掺假现象较为严重。

鲜奶以及其他奶制品掺假行为也十分猖獗,除2008年的“三鹿事件”引发的奶制品产业的“大地震”之外,仍存在其他的掺豆浆、淀粉和米汁、植物蛋白现象。类似的报道还有很多,在此就不一一列举。

天然发菜是中国西部地区特有的陆生性蓝藻类发状念珠藻植物,生长分布在荒漠-半荒漠草原丘陵裸地上,由于其生物学特性和独特的生态自然环境条件,迄今尚不能进行人工种植。宁夏发菜丝体细长,色泽乌黑,富有韧性,营养物质含量丰富,为国内同类发菜之上乘。为利益驱动,少数加工者用其它原材料,采用一些特殊手段加工成人造发菜,其形态和天然发菜极其相似,并将其掺入天然发菜中,目前相关部门对天然发菜中掺有人造发菜的比例进行鉴别较为困难。

饮料也未能幸免,其中尤以果汁掺假现象更为突出。真正意义上的“100%鲜果原汁”是新鲜水果采摘鲜榨后,经蒸发、冻结、反渗透等工序成为“浓缩果汁”,再以热罐生产程序,加入纯水将浓缩果汁还原而成。而目前市场上一些所谓“100%果汁产品”却只是用浓缩果汁加糖、水、香料调配成不同浓度的“果汁饮料”;更有甚者,为了降低成本,不惜用各种方法制作掺假果汁,从最初用蛋白糖、山梨酸钾、柠檬酸、黄原胶和自来水,加各种色素和香精勾兑各种果汁饮料,到如今通过加果渣提取液、往价格高的果汁中添加价格低的果汁等掺假果汁,如在苹果汁中添加梨汁或白葡萄汁,橙汁中添加柑橘汁、西柚汁,红色浆果汁添加苹果汁或红色浆果汁之间的互相添加等,虽然对人体无直接危害,但这种投机取巧、以次充优的违法行为严重损害了消费者利益,也直接影响我国果汁的出口贸易。

2PCR技术在植物性食品检测和食品掺假中的应用

目前基因检测技术已经开始在许多领域应用,比如作物种子真伪的鉴别、中药材真伪鉴别、作物中转基因成分的检测、饲料中转基因成分的检测、动物育种选种等。基因检测技术的基础是PCR技术,在此基础上还发展了反转-PCR(RT-PCR)、随机扩增的多态性DNA技术(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)、mRNA差示技术、免疫PCR等技术。

目前我国已颁布多项转基因食品定性、定量检测的国家标准,但缺乏单纯用于植物性转基因食品的监测。近年来,有多篇报道植物性转基因的PCR法检测。

转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列。目前已有研究通过设计并合成两对不同的引物:35S-1/35-2:5-GAT TCC ATT GCC CAG CTA TCT G-3, 5-TAG AGG AAG GGT CTT GCGAAG G-3;NOS-1/NOS-2:5-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3, 5-CGA ATT CCC GAT CTA GTA AC-3。建立PCR-酶切分析-Southern杂交检测并确认转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法。此方法适用于快速检测含有这两种序列的转基因植物及其食品。该套方法同时检测CaMV 35S和NOS基因双元件,在一定程度上可避免某些植物因自然感染花椰菜花叶病毒或根癌农杆菌产生的假阳性结果。在进行 PCR 检测时首先设立了阴性、空白和阳性对照,其中用阳性质粒对照先确定 PCR扩增的温度、 时间和循环次数等反应条件;同时用3 个对照检查扩增系统能否正常工作,以排除假阳性及假阴性结果;其次在实物检测过程中,每个样品都做了两个平行实验以确保结果的准确性;最后,对阳性检测结果进行酶切和 Southern 杂交确认,以验证结果的可靠性。

目前,对于掺假行为的鉴别,大多采用感官评定及化学仪器方法,如分光光度法、紫外光谱法、红外光谱法、高效液相色谱法、质谱法等,对某些掺伪产品可以做出准确的鉴别,但也存在较多的盲区,尤其对有不同来源的掺假物无能为力。

以PCR为基础的基因检测技术不仅能够鉴别食物中的转基因成分,同时还能检测食物中的致病菌、食品中成分的种类、食品中的有效成分,因此也能对食品中掺杂的其它生物成分进行鉴别检验。这就是在基因检测技术的基础上发展起来的DNA指纹技术。微量DNA提取技术和PCR扩增RAPD随机扩增标记技术的发展,使人们能从植物材料中提取微量的DNA,为用DNA技术鉴别产品的真伪提供了可能。

DNA指纹图谱技术(RAPD)应用于食品的掺假检验鉴定使用仪器包括PCR仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统等。首先提取食品单一原料基因组DNA,经PCR反应,根据已建立的原料RAPD反应体系,从引物中筛选出数条有效引物,再用这些有效引物对原料品种进行RAP分析,100bp DNA ladder marker用于DNA指纹构建,由此构建出食品原料的DNA指纹图谱,作为鉴定的分子依据;其次依照与上述相同的方法构建食品成品基因图谱;最后,将成品基因图谱与原料基因图谱进行比对,如果二者图谱相似,说明没有掺杂其他物质,如果成品图谱中出现了多余的条带,说明添加了其他的物质。根据图谱中多余条带的特点,查阅已有的基因图谱文库,确定掺杂的物质以及与原料物质的亲缘关系、生物学特性等。

3结论

由于我国目前缺乏对市场中植物性食品专门的检测标准,食品质检部门可根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列,采用两对不同的引物,通过PCR-酶切分析-Southern杂交检测并确认转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法,用于快速检测含有这两种序列的转基因植物及其食品。

利用DNA指纹图谱技术(RAPD)对食品中掺杂的物质进行检测,根据不同物种基因的特异性,对DNA抽取后进行进行PCR扩增并分析,不仅快速准确,而且能够定位掺杂物质与原料的关系。这项技术解决了其他理化方法不能解决的食品掺假的问题,能从根本上区分从外形和理化分析无法判别的物质。以上技术从国内外的研究都十分成熟,因此应将此技术推广,应用于质量技术监督部门和食品质检部门对食品质量的监督检查、打击假冒伪劣食品中,从而可有效杜绝酱油中掺动物和人的毛发、火腿中掺杂其他禽畜肉或无肉等现象,逐步减少市场中掺伪食品,尽快地使食品生产,经销走上卫生文明的轨道,使得食品工业健康稳定的发展。