腺病毒与慢病毒载体对人脂肪间充质干细胞转导效率及基因表达的差异

李　丹　乔　群　王晓军　钱建平

[摘要]目的:比较重组腺病毒、慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白对体外培养的人脂肪来源干细胞(hADSCs)的转导效率和外源基因表达差异。方法:原代分离培养hADSCs并鉴定，应用Ad5F35-EGFP及LV-EGFP以MOI=0、25、50、100、200、400、800 感染hADSCs，在1、3、7、14、21天应用荧光显微镜、流式细胞仪观察检测表达EGFP细胞阳性率。MTT法检测转导对hADSCs增殖的影响。Von Kossa染色、油红O染色检测体外诱导转导EGFP的hADSCs向成骨及成脂方向分化能力。结果:hADSCs细胞表面标记CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR阴性，CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166阳性。荧光显微镜观察Ad5F35-EGFP 感染hADSCs后（1～7天）可见EGFP高表达，此后逐渐减弱；LV-EGFP感染hADSCs后21天，仍可见EGFP高表达。流式细胞仪检测Ad5F35-EGFP、LV-EGFP对hADSCs转导效率与MOI值呈正相关。MTT显示Ad5F35-EGFP在高MOI值（800）检测A值与对照组相比差异显著（P<0.01）。转导EGFP的hADSCs经体外诱导14天可向成骨、成脂方向分化。结论:与腺病毒相比，慢病毒能够更为安全、有效地感染体外培养hADSCs，并长期表达外源基因，是研究基因修饰hADSCs的理想载体。

[关键词]人脂肪间充质干细胞；基因治疗；腺病毒；慢病毒

[中图分类号]Q343.6 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0342-04

Transduction of human adipose tissue-derived stromal cells using lentiviral vector and adenoviral vector: a comparative study

LI Dan，QIAO Qun，WANG Xiao-jun，QIAN Jian-ping

（Plastic & Aesthetic Surgery Center, Peking Union Medical College Hospital，Peking Union Medical College，Beijing 100032，China）

Abstract： Objective To compare the efficiency of human adipose tissue-derived stromal cells (hADSCs) transduced by adenoviral vector and lentiviral vector. Methods Adipose tissues were isolated to obtain hADSCs. Ad5F35-EGFP and LV-EGFP were constructed and transduced hADSCs at multiple of infection MOI ranging from 0,25,50,100,200,400,800. At 1,3,7,14,21d post transduction,EGFP positive was detected by fluorescence microscopy and flow cytometry (FCM), which was followed by cell proliferation determination assessed with MTT assay at different MOIs. After induction of hADSCs modified with EGFP, von Kossa staining and red oil O staining were performed to test the formation of calcium and oil concentration. Results hADSCs's marker CD31,CD34,CD45,CD106 and HLA-DR were negative,CD29,CD44,CD49d,CD105,CD166 were positive. Fluorescence microscopy detected high EGFP. signal with hADSCs at 1d to 7d after infection by Ad5F35-EGFP and high EGFP signal with hADSCs at 21d after infection by LV-EGFP.FCM results showed that MOI of Ad5F35-EGFP and LV-EGFP enhanced transduce efficiency of hADSCs in a dose-dependent manner. MTT assay showed that Ad5F35-EGFP( MOI=800) A had great contrast with control group（P<0.01）. ADSCs encoding EGFP after differentiation into adipogenic and osteogenic lineages after lentiviral and adenoviral transduction. Conclusion Lentivirual vectors applied at high MOIs can result in integration and long-term gene expression.

Key words: human adipose tissue-derived stromal cells; gene therapy; adenovirus; lentivirus

脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs) 是一类与骨髓间充质干细胞类似，具有多向分化潜功能的成体干细胞[1]。Zuk等在脂肪抽吸物中成功分离培养人脂肪间充质干细胞（hADSC），并发现其具有向脂肪、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞分化的潜能[2]。对hADSCs进行基因修饰及标记示踪，已成为研究其分化调控机制及细胞基因治疗的热点。病毒载体系统以其较高的转导效率和良好的靶向性在基因治疗中应用广泛，不同类型病毒载体具有各自的优缺点。本研究比较携带增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的梯度重组腺病毒（Adenovirus,Ad）及慢病毒（Lentivirus,LV）载体对体外培养hADSCs的转导效率和基因表达水平，并观察该基因修饰对hADSCs分化的影响，为进一步研究利用hADSCs进行基因治疗提供实验依据。

1材料和方法

1.1 hADSCs分离、培养扩增、细胞表面标志的检测鉴定：脂肪组织取自在北京协和医院整形美容外科接受腹部脂肪抽吸术的健康青年女性（5例），采取组织前均签署知情同意书。无菌条件下，在局部肿胀麻醉下采用注射器法抽取50ml颗粒脂肪组织，静置30min，去除上清液体，应用0.075%I型胶原酶（Sigma）37℃水浴震荡消化30min细胞分散，应用等量含10%胎牛血清（HYCLONE）的低糖DMEM（GIBCO）中和胶原酶，800×g离心10min，重悬接种至25cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中。细胞融合至70%～80%后，以0.05%胰蛋白酶/EDTA消化，1:2比例传代[3]。细胞接种后每次换液时用倒置相差显微镜（Olympus）观测细胞生长与形态变化。取培养的第3代hADSCs经过消化离心(1000r/min，5min)后细胞重悬；细胞计数后将细胞浓度调整为1×10⁸/L，分别于小鼠抗人CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD106、CD105、CD166、CD49d和HLA-DR单克隆抗体（Santa Cruse）室温反应30min，PBS洗涤2次后于FITC标记的山羊抗小鼠Ig-G（北京中杉金桥）避光作用30min，PBS重悬细胞，应用流式细胞仪（Beckman Coulter）检测细胞表面标志。

1.2 重组腺病毒、慢病毒载体体外感染hADSCs：本实验应用的病毒载体均携带巨细胞病毒CMV启动子调控的增强型绿色荧光蛋白( EGFP)报告基因：5型、外壳纤维为35型嵌合型重组腺病毒（Ad5F35-EGFP）滴度为9×109 pfu/ml；第三代慢病毒（LV-EGFP），滴度为2×10⁸TU/ml，由北京本原正阳基因技术有限公司提供。采用第3代hADSCs，按每孔1×105接种到24孔板中，1天后细胞贴壁，将Ad5F35-EGFP及LV-EGFP分别以感染复数（multiple of infection，MOI）=0、25、50、100、200、400、800，其中MOI=0为对照组，加入到hADSCs细胞培养液中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱培养12h后，培养液更换为含10%FCS的L-DMEM。

1.3 重组腺病毒、慢病毒载体对体外培养hADSCs的转导效率及增殖的影响：病毒载体对hADSCs的转导效率用报告基因EGFP的表达来反映。分别于感染后1、3、7、14、21天，感染细胞在倒置荧光显微镜（LSN 510，Zeiss）下观察EGFP的表达，以表达EGFP细胞为阳性细胞。同时各组感染细胞分别加入0.25%胰蛋白酶消化，250μl PBS重悬后于200目滤网过滤送检，应用流式细胞仪对各组EGFP阳性细胞率进行定量分析。MTT法观察Ad5F35-EGFP及LV-EGFP对hADSCs增殖的影响：取感染后0、1、2、3、4、5、6、7天作为检测点，向各孔加入MTT (Sigma) 20μl，37℃,5%CO₂培养箱内孵育3h后吸弃上清, 加入150μlDMSO(Sigma)后轻柔振荡10min。在酶联免疫检测仪（Bio-rad）490nm波长下读取光吸收值A，计算平均值并绘制生长曲线。

1.4转基因hADSCs体外诱导分化能力检测：病毒载体感染后第3天，各组转导EGFP基因的hADSCs经消化以每孔3×105接种至6孔板中，待细胞融合80%时，进行体外分化诱导实验。在倒置显微镜及荧光显微镜下观察并摄影。

1.4.1 转基因hADSCs向成骨细胞分化：细胞在成骨诱导分化体系即地塞米松（10-7mol/L）、β-甘油磷酸钠（10mmol/ L）、维生素C（50mg/L）中诱导培养14天，用von Kossa染色法检测钙化小结。

1.4.2 转基因hADSCs向成脂细胞分化：细胞在成脂诱导分化体系即地塞米松（10-6mol/L）、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤IBMX（0.5mmol/L）、胰岛素（10μg/ml），吲哚美辛（100μmol/l）中诱导14天，油红O染色法检测脂滴。

1.4 统计学处理：实验所得数据采用SPSS13.0统计分析软件进行分析，应用t检验检测组间差异，并以均数±标准差( x±s)表示，P<0.05表示有统计学意义。

2结果

2.1体外分离、培养hADSCs的形态观察与鉴定：原代细胞接种1天后在倒置显微镜下可观察到散在的多角形贴壁细胞，7天后细胞形态逐渐转化为成纤维细胞样的长梭形(图1)，细胞融合后呈放射状或漩涡状，生长迅速，倍增时间约24～28 h，P3代至P10代细胞间无明显形态变化。取第3代细胞行流式细胞仪检测结果显示：细胞表面分子CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166呈阳性表达，CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR呈阴性表达(图2)。CD49d和CD106是脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的区分标记[1]，表型鉴定可初步确定为hADSCs。

2.2Ad5F35-EGFP及LV-EGFP对体外培养hADSCs的转导效率：Ad5F35-EGFP（MOI=25、50、100、200、400）感染hADSCs，1天后倒置显微镜即可观察到EGFP阳性细胞，随着病毒量增加，表达EGFP的细胞阳性率增加。感染后3天各组EGFP表达达到高峰，并可维持至感染后7天，此后至14天左右，阳性细胞数量开始减少，荧光强度逐渐降低至至消失。Ad5F35-EGFP（ MOI=800）对hADSCs有细胞毒性(部分细胞皱缩死亡)，后续的实验无法继续进行。LV-EGFP（MOI=25、50、100、200、400、800）感染hADSCs后，1天观察到少量细胞表达EGFP，随着时间延长，EGFP阳性细胞逐渐增多，直至7天表达EGFP细胞数量及亮度不再有明显变化，此时MOI=25转导效率为（15.5±1.4）%，随着MOI增加转导效率逐渐增加，最高至MOI=400时为（92.0±1.7）%，MOI=800时转导效率无显著提高。LV-EGFP感染后21天仍可见大量EGFP阳性细胞。感染后7天相同MOI值条件下，Ad5F35-EGFP对细胞的感染效率均高于LV-EGFP(P<0.05)。流式细胞仪定量检测感染后hADSCs表达EGFP阳性率结果见表1。

2.3MTT法检测结果：Ad5F35-EGFP及LV-EGFP在MOI值=25、50、100、200、400时感染hADSC所检测A值，与对照组（MOI=0）相比无显著差异(P>0.05)。在高MOI（800）条件下，Ad5F35-EGFP对hADSC增殖有抑制作用，LV-EGFP与对照组A值相比无明显差异，见图2。

2.4转基因hADSCs体外诱导分化能力检测

2.4.1 转基因hADSCs成骨诱导分化：转染EGFP基因的hADSCs经过成骨诱导培养体系培养14天后，行Von Kossa染色发现有明显的钙化基质沉积，在倒置荧光显微镜下可观察到成骨分化后的细胞仍然表达EGFP (图3A，3B)。

2.4.2 转基因hADSCs成脂诱导分化： 转染EGFP 基因的hADSCs经过成脂诱导培养体系培养14天后，光镜下可见80%以上的细胞胞浆内充满脂肪小泡，油红O染色呈阳性反应，对照体系不表达或只有微量表达。在倒置荧光显微镜下观察到分化后的细胞仍然表达EGFP (图4A、4B)。

3讨论

hADSCs具有组织来源丰富，获取效率高，可诱导分化为成骨、软骨、脂肪、肌及神经前体细胞，分泌肝细胞生长因子、转化生长因子β等细胞因子，以旁分泌方式促进血管新生并保护缺氧细胞等特点[5-6]，在基因治疗及组织工程再生医学领域具有重要的应用价值。本研究通过流式细胞仪检测细胞表面分子结果显示：CD31、CD34、CD45、CD106和HLA-DR阴性，CD29、CD44、CD49d、CD105、CD166阳性。其中CD105和CD166为干细胞标志分子[7]；hADSCs表达CD49d，不表达CD106，与文献报道一致[4]；HLA-DR阴性表明其具有同种异体移植的可能性[8]。通过对细胞表面标记检测，实验所获得的细胞可初步确定为hADSCs[9]。

选择合适的载体将目的基因有效整合到hADSCs并保留其干细胞多向分化的特性，是研究hADSCs体内、外分化潜能及跨胚层分化潜能的关键步骤。腺病毒载体靶细胞范围广，能感染复制分裂细胞及非分裂细胞，感染效率及外源基因表达水平高，不整合入宿主细胞DNA，外源基因的表达随着时间的延长而减弱[10]，被广泛用于基因治疗、基因疫苗等实验研究，其中Ad5F35型腺病毒载体对Ad5型腺病毒载体感染较差的细胞，特别是造血系统细胞、干细胞及部分肿瘤细胞的转导效率较高[11-12]。慢病毒载体是一类逆转录载体，其基因组能整合入宿主细胞基因组，持久稳定表达外源基因。“第三代”慢病毒载体，其基因组的3'LTR的增强子功能缺失，从而形成自灭活（Self-inactivation,SIN），具有良好的安全性；病毒包膜上嵌合了来自水泡口炎病毒的VSV-G蛋白，使病毒能感染分裂和非分裂细胞。与MuLV等逆转录病毒载体有致瘤活性相比，慢病毒载体未发现有致肿瘤活性[13]。

本实验使用了携带EGFP报告基因的Ad5F35与第三代LV载体分别对hADSCs进行感染，检测转导效率和外源基因表达差异。实验结果表明，Ad5F35-EGFP、LV-EGFP均可以有效感染体外培养的hADSCs并表达外源基因EGFP。Ad5F35-EGFP感染hADSCs后1周内可见EGFP高表达，而LV-EGFP感染hADSCs后21天，仍能观察到EGFP高表达。在相同MOI值条件下，Ad5F35-EGFP对hADSCs的转导效率均高于LV-EGFP。转导效率与病毒的用量间存在量效关系。在实验中我们还观察到，Ad5F35-EGFP在高MOI值（800）时对hADSCs有细胞毒性。因此，尽管Ad5F35对hADSCs的转导效率略高于LV，但LV在外源基因表达时长及安全性方面更具优势，LV作为hADSCs的外源基因修饰载体，具有良好的应用前景。

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[收稿日期]2009-01-28[修回日期]2009-02-12

编辑/张惠娟