大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合中血管形成与血流变化特点

刘文忠　陈志刚　孙同柱　付小兵

[摘要]目的：观察大鼠深Ⅱ度烫伤模型创面愈合中血管形成与血流改变的特点。方法：Wistar大鼠48只，随机分为A、B两组，A组（n=42）：为组织病理观察组，根据实验设计又分伤后即刻、1天、3天、7天、14天及21天及正常对照组，每组6只；B组（n=6）：为血流量检测组。在实验大鼠背部制作深Ⅱ度烫伤模型，A组大鼠在各时间点活杀取材，进行病理和免疫组化检测；B组大鼠连续检测背部同一部位正常皮肤及伤后各时间点的创面血流量。结果：烫伤大鼠伤后3～7 天，肉芽组织内出现单个的不成腔的血管内皮细胞，数目随肉芽组织的增多而逐渐增加，后逐渐形成管腔；伤后14 天，肉芽组织内有腔毛细血管进一步增多，已出现结构较完整的成熟小血管；伤后21 天血管形态和数量已接近正常皮肤。深Ⅱ度烫伤大鼠伤后即刻，皮肤血流量锐减为正常皮肤血流量的51%；伤后3 天时，创面血流量仅达正常血流量的68%；至伤后14 天，创面血流量升到正常值的88%；14 天后逐渐正常。结论：在皮肤深Ⅱ度烫伤创面愈合过程中，随着肉芽组织内内皮细胞数量和结构的变化，创面的血流量不断增加，前者的变化是后者变化的基础。

[关键词]烫伤；创面愈合；血管；内皮细胞

[中图分类号]R622.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2009）03-0328-04

Changes of blood flow and formation of blood vessels during wound healing after deep Ⅱ degree scald in rats

LIU Wen-zhong1,CHEN Zhi-gang2,SUN Tong-zhu3,FU Xiao-bing3

（1.Department of Anatomy,Medical College of Inner Mongolia, Hohhot 010059, Inner Mongolia,China; 2. Department of Urologic Surgery,Beijing General Hospital of Aerospace,Beijing 100076,China; 3 Institute of wound healing,First clinical hospital of China PLA General Hospital,Beijing 100037,China）

Abstract: Objective To explore the relationship between blood flow and formation of blood vessels during wound healing process after deep Ⅱ degree scald injury in rats. Methods 48 Wistar rats were randomly divided into pathological observing group (group A, 42 rats) and blood flow detecting group (group B, 6 rats). Group A was further divided into 6 subgroups according to the postburn period, which were immediately after scald, 1, 3, 7, 14 and 21 days after scald and normal control. Deep Ⅱ degree scald in rats was made on either side of back by using a metal scald machine. Rats in group A were sacrificed at different time points and specimens were collected for pathological and immunohistochemistry observation. Rats in group B were kept alive for detecting blood flow at the same position of the wound at different time points. Results Single endothelial cell was observed and increased to form the cavity from 3 to 7 days after injury, the endothelial cell numbers increased in accordance with the formation of granulation tissues. 14 days after injury, blood capillary with cavums in granulation tissues increased and even mature small vessels with intact structures were found. The shape and numbers of blood vessels were near to normal after 21 days. Blood flow decreased dramatically immediately after thermal injury, which was about 51% of the normal value. However, it reached to 68% after 3 days and 88% after 14 days of normal value. After 14 days, the value was almost back to normal. Conclusions During the wound healing process after deep Ⅱ degree scald injury in rats, blood flow increased gradually in accordance with the changes of endothelial cells in granulation tissues. The numbers and structure of endothelial cells affecting the changes of blood flow.

Key words: scald injury; wound healing; blood vessel; endothelial cell

血管作为人体内重要的组成部分是营养物质、代谢产物和一些生物活性物质的主要传递途径，在损伤修复过程中的作用至关重要[1-2]。本研究利用大鼠背部皮肤深Ⅱ度烫伤创面愈合模型，采用免疫组化技术观察伤后各时间点血管内皮细胞形态，并对创面伤后各时间点的血流量进行检测，观察两者在创面愈合过程中的变化规律及两者间的关系，以助于对创面愈合过程的认识，丰富创伤修复的理论，为临床创面治疗提供理论依据[3-4]。

1材料和方法

1.1 主要试剂和溶液：抗体FactorⅧ Related Antigen（购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.）；二步法免疫组化检测试剂盒（购自北京中山生物技术有限公司）。

1.2 主要仪器：图像分析仪（瑞典）、激光多普勒血流检测仪（美国）、激光共聚焦显微镜。

1.3实验动物分组及模型制备

1.3.1 实验动物及分组：选用健康雄性Wistar大鼠48只，体重0.22～0.25kg，购自军事医学科学院动物中心。将大鼠随机分为A、B两组，A组42只，为组织病理观察组，根据实验设计又分为：伤后即刻、1 天、3 天、7 天、14 天及21 天组及正常对照组，每组6只；B组6只，为血流量检测组，连续检测大鼠背部同一部位正常皮肤及伤后即刻、伤后1 天、3 天、7 天、14 天及21 天创面血流量。

1.3.2 烫伤模型制备：将大鼠用速眠新（0.1 ml、肌注）麻醉后，背部净毛，用金属烫伤器在背部两侧分别制做一个深Ⅱ度烫伤创面（70℃、8s），创面为圆形，直径18 mm，面积2.54 cm2。（以上致伤条件预实验已经病理切片证实）。

1.4 标本采集与处理：A组大鼠在各时间点活杀取材（创面及周围0.5cm正常皮肤），所取组织经10%福尔马林固定后，常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋后，用于组织病理学、免疫组化检测。

1.5检测指标及方法

1.5.1大体观察：观察烫伤后各时间点，创面颜色、形状、大小及质地的变化。

1.5.2 创面面积：伤后3天、7天及14天采用画膜称重法测量B组及A组剩余大鼠创面面积。用透明膜覆盖创面，沿创缘画膜，剪膜，置分度值为0.1mg的分析天平称重换算成创面面积。

1.5.3血流量检测：采用彩色激光多普勒血流量检测仪，分别检测B组大鼠背部相应部位致伤前正常皮肤及伤后即刻、伤后1 天、3 天、7 天、14 天及21 天创面血流量。

1.5.4病理学观察：利用HE染色光镜下观察伤后各时间点创面肉芽组织生长及愈合的组织学特征。

1.5.5免疫组织化学检测：检测大鼠正常皮肤及伤后各时间点FactorⅧ 的表达。具体方法如下参见试剂盒。

1.6图像分析：组织切片及照片均进行电脑图像分析。

1.7统计学处理：各项指标均以平均值±标准差（x±s）表示，数据应用STATA（7.0版本）软件进行统计分析，计量资料使用F检验进行统计学处理，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

2结果

2.1 烫伤大鼠创面的大体观察：各组大鼠烫伤即刻：创面苍白，创缘整齐，创面形状呈圆形，质地略变硬。随后创缘及周围皮肤水肿加重；伤后3天：创面呈圆形或椭圆形，面积变小，创面形成棕褐色硬痂，创面略凹陷，周围正常皮肤仍有水肿反应，用画膜称重法测得创面面积为（1.94cm±0.18）cm2；伤后7天：创面进一步缩小、变硬，硬痂颜色加深呈深褐色，部分创面在创缘处硬痂与创面分离，创面有鲜红色肉芽组织形成；创面面积为（1.18±0.25）cm2；伤后14天：绝大部分创面硬痂自行脱落，创面明显缩小，创面中央残留有小面积未愈合创面；创面面积为（0.09cm±0.07）cm2；伤后21天：全部创面愈合。结果参见表1。

2.2 创面愈合过程中微血管的变化：免疫组化及免疫荧光染色显示：血管内皮细胞染成棕黄色或被染成红色荧光。正常大鼠皮肤：在真皮各层次内均可见血管分布，部分血管腔内可见红细胞充盈。在皮肤附件周围血管密度较高，并且血管断端口径由浅层向深层逐渐增大；伤后1天，创面血管管壁增厚，周围有炎性细胞积聚，腔内有红细胞黏附；伤后3～7天，随着创面肉芽组织的生成，肉芽组织内出现单个的不成腔的，或成簇状的血管内皮细胞，数目随肉芽组织的增多而逐渐增加。新形成的血管内皮细胞大多沿与创面垂直方向生长，形态由刚形成时单个或无腔的簇状逐渐转变为有腔，进而腔内有红细胞充盈。伤后14天，单个或无腔的簇状内皮细胞数目减少，在较早形成的肉芽组织内创面有腔毛细血管进一步增多，已出现结构较完整的成熟小血管；伤后21天，血管形态和数量接近正常皮肤。结果参见图1～4。

2.3 创面血流量的变化：采用瑞典产PIMⅡ型激光多普勒血流检测仪，将6只大鼠在相同条件下，分别测量背部同一部位3cm×3cm的正方形区域（创面位于该区域中央）内正常皮肤、伤后即刻、伤后1天、3天、7天、14天及21天的血流量值，数值以图像电压值V表示。正常皮肤：可见分布较均匀的血流回声（图5a所示），该区域血流量平均值（1.75±0.29）V；伤后即刻：创面区域出现无血流区，创面周围血流正常或稍高（图5b所示），区域总体血流平均值（0.90±0.10）V，与烫伤前正常皮肤血流量值相比，P＜0.01；伤后1天：创面区无血流回声，但创缘出现高血流区带（图1c所示），区域总体血流平均值（1.17±0.12）V，与烫伤后即刻血流量值相比，P＜0.01；伤后3天：创面仍无血流回声，但无血流面积缩小，创缘强回声区带略减弱（图5d所示），区域总体血流平均值（1.19±0.14）V，与烫伤后1天皮肤血流量值相比，P＞0.05，与烫伤前正常皮肤血流量值相比，P＜0.01； 伤后7天：创面无血流区域进一步缩小，区域总体血流量增加到（1.47±0.15）V（图5e所示），与烫伤后3天皮肤血流量值相比，P＜0.01，与烫伤前正常皮肤血流量值相比，P＜0.01；伤后14天：创面无血流区域基本消失，创面周围血流降低（图5f所示），区域总体血流平均值（1.54±0.18）V，与烫伤后7天皮肤血流量值相比，P＞0.05，与烫伤前正常皮肤血流量值相比，P＜0.01；伤后21天：创面区域血流量接近正常（图5g,h所示），区域总体血流平均值（1.70±0.18）V，与烫伤后14天血流量值相比，P＜0.01，与正常皮肤血流量值相比，P＞0.05，此时创面已完全愈合。结果见图5a～g、表1。

3讨论

烫伤皮肤创面愈合是一个受多因素影响的过程。血管作为人体内重要的运输系统，为组织修复运输营养物质、代谢产物和一些生物活性物质，是修复过程中一切修复程序得以正常进行的后勤保障，其在损伤修复过程中的作用是至关重要的[5-6]。传统创伤修复理论将愈合过程分为炎症、肉芽组织增生、再上皮化和改建塑形几个阶段，其中微小血管的变化贯穿于始终。大量研究表明，毛细血管形成的时间、多寡和质量直接影响到创伤愈合的程度，但具体的分子机制尚不清楚[7]。创面新生毛细血管在各种调节因素的精密调控下，形态结构不断成熟，功能逐渐完善[8]。本实验选用大鼠作为实验动物，首先建立深Ⅱ度烫伤创面愈合模型，观察烫伤创面毛细血管内皮细胞结构和功能的变化，检测血流量改变与创面愈合间的规律，这将有助于进一步认识血管形成与创面所需营养物质转运的关系。

烫伤对皮肤局部血管的直接伤害以及继发的炎症反应，造成该部位血管结构和功能的改变，导致创面及周围皮肤组织的血流障碍，障碍程度与血管损伤程度密切相关。皮肤烫伤后，其创面由受热中心部向外可为三个区带，即中心凝固坏死区、组织变性区和组织反应区。其中凝固坏死区局限于热源接触部位，为不可逆损伤，深Ⅱ度烫伤时累及表皮层和大部分真皮层，真皮层内血管发生凝固性坏死，外观苍白；组织变性区位于凝固性坏死区外侧，呈渐进性坏死状。在无感染的情况下，为可逆性损伤，此区内有严重的充血和血栓形成；组织反应区位于最外侧，此区皮肤血管不同程度扩张和充血，外观红色，压之褪色。本实验借助深Ⅱ度烫伤创面愈合模型，选取包括以上三个区带在内的皮肤区域作为血流量检测部位，动态观察该区域血流量变化，可更客观地反映烫伤后创面修复过程中创面血流变化规律。检测发现：烫伤后即刻创面中心凝固坏死区无血流回声；HE病理组织染色可见真皮内中、浅层血管发生凝固性坏死和真皮深层内血管血栓形成。伤后1天，创面血流图中心凝固坏死区仍无血流回声，但在组织变性区和组织反应区出现血流回声增强区带，考虑为炎性反应使该区域内血管扩张、充血所致，这种炎性充血在伤后3天血流图仍可见到。伤后3天无血流区有所缩小，说明创面收缩及组织变性区部分血管功能开始恢复。所选检测区域伤后即刻、伤后1天、伤后3天与伤前血流量相比均有极显著性差异（P＜0.01），且伤后1天、伤后3天与伤后即刻相比也存在极显著性差异，但伤后1天和伤后3天之间相比无统计学意义。伤后7天创面血流量进一步增加，无血流区域明显缩小，与伤后3天相比有极显著性差异，此时是创面愈合过程中肉芽组织形成高峰期，创缘肉芽组织内毛细血管大量增生。伤后14天无血流面消失，HE染色可见创区已被自创缘生长而来的肉芽组织所完全填充，总体血流量增加。伤后21天时，创面血流图和伤前正常皮肤已接近，血流量经统计学分析较伤后14天有极显著性增加，但与正常皮肤血流量无统计学差异。这种血流变化的规律与创面修复过程密切相关，其中的分子机制更加引起人们的重视。Ⅷ因子相关抗原被认为是血管内皮细胞最特异性的标志[9]，是观察血管内皮细胞变化的一个可靠指标。本实验采用Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色方法，对创面愈合过程中血管内皮细胞变化规律进行观察，所得出的创面微血管形成特点与HE染色一致。

创伤愈合过程中，肉芽组织生成与退缩是伤口愈合和组织重建的关键步骤[10]。而肉芽组织中富含的毛细血管组织更是参与肉芽组织的生成与退缩。新生毛细血管的变化也从一个侧面反映了创伤修复整个的生物学机制[11]。正常的创伤修复是一个严格、有序的调节过程。组织修复初期，各种细胞反应性的增殖、迁移和转化，满足组织修复的需要[12]。随着伤口的闭合，完成各种作用的修复细胞迅速以凋亡的方式减少或消失，彼此间在时、空上的协调维持机体的完整性和稳定性[13-14]。毛细血管形成的时间、多少以及消退的时机是创面愈合的结局中发挥作用重要的一部分[15-16]。

以上的研究结果可以清楚显示，当机体遭受损伤后，即刻出现血流的改变，随后大量的血管内皮细胞增殖，并逐渐相互连接成管腔，为血流灌注提供通路，携带更多的养料、氧气等物质到达创区参与代谢，但此时的血流量与血管内皮细胞的再生并非同步增长，伤后14天血管内皮细胞的数量达到最高峰，但血流并没有达最大值，说明有一些管腔可能为无效管腔，无供血和运输功能，他们将随着创面愈合的完成逐渐退变。因此，再上皮化完成后，血管内皮细胞数量减少，新生血管的消退、改建也逐渐完成，血流量逐渐恢复，接近正常水平。另外，组织内的胶原纤维也重排，参与完成愈合改建。有关内皮细胞增殖、迁移和凋亡的启动机制对尚需作进一步的研究，借助信号转导、基因敲除等研究手段，此方面的研究正不断地深入。彻底阐明创面愈合的分子机制，特别是血管结构与功能的变化规律，将为以后采取创面愈合基因治疗方法，在时空上调节愈合进程，改善修复质量产生深远的影响。

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[收稿日期]2008-11-20[修回日期]2009-02-04

编辑/张惠娟