正交设计优选钩藤碱的提取工艺

李晓云　叶小利　牛小花　李学刚　王立军

（1.西南大学 药学院药用资源化学研究所，重庆 400715；2.西南大学 生命科学学院,重庆 400716）お

摘 要：目的：优化钩藤中钩藤碱的提取工艺。方法：以钩藤碱得率为检测指标, 采用L⁹(3⁴)正交试验, 考察乙醇体积分数、提取时间和提取次数3个影响因素, 采用高效液相色谱法进行钩藤碱测定。结果：提取次数和乙醇的体积分数对检测指标均有显著影响，提取时间影响不显著。最佳提取工艺条件为90 %乙醇热回流3 次, 每次3 h。结论：优选得到的工艺稳定、方法可行。

关键词：钩藤;钩藤碱;正交设计; 高效液相色谱法

中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）01-0049-02

钩藤为茜草科植物钩藤（Uncaria rhynchophylla〔Miq.〕Jacks.）、大叶钩藤（Uncaria macrophylla Wall.）、毛钩藤（Uncaria hirsute Havil）、华钩藤（Uncaria sinensis〔Oliv.〕 Havi.）或无柄果钩藤（Uncaria sessilifructus Roxb）的干燥带钩茎枝^[1]。具有清热平肝，息风定惊之功能。用于头痛眩晕，感冒夹惊，惊痫抽搐，妊娠子痫^[1]。其主要有效成分为吲哚类生物碱，具有降血压、抗心律失常、镇静、抗癫痫以及对脑的保护作用^[2-3]。常规制剂中其有效成分的提取主要采用水煮浓缩法和70 %～75 %乙醇提取法^[4]，本实验以此为基础，采用乙醇回流提取法提取钩藤中生物碱的正交试验优化，对不同工艺总生物碱的提取率进行考察，为钩藤的综合利用提供参考依据。

1 仪器与材料

LC-6AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；药材粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；TG16-W微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；TG16-W微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

钩藤药材购买于重庆天圣奇仙药业有限公司，经作者鉴定为茜草科植物钩藤（Uncaria rhynchophylla〔Miq.〕Jacks.）；钩藤碱对照品(购买于上海融禾医药科技发展有限公司，含量>99%)，甲醇为色谱纯，水为超纯水（经Millopor溶液过滤系统处理），其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计

选用L₉（3⁴）正交表进行正交实验设计，因素水平安排见表1。

2.2 供试品溶液的制备

称取干燥至恒重的钩藤粉末（过40目筛）50 g，精密称取9份，按1-9进行编号，按照正交实验要求进行操作。提取后再称定重量，分别用相应浓度的乙醇溶液补足各编号样品减失重量，摇匀，静止，取上清液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作供试品溶液。

2.3 钩藤碱的测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水=55∶45（含三乙胺0.01moL/L，冰醋酸调pH=7.5）；流速1mL/min；检测波长：λ=254nm；进样量20μL；柱温：30 ℃。

2.3.2 线性关系考察

精密称取钩藤碱对照品2 mg，甲醇定容于10 mL容量瓶中，摇匀，得钩藤碱对照品溶液，备用。精密量取上述对照品溶液50、100、200、400、800 μL，分别用甲醇定容至2mL，配制得系列对照品溶液。按“2.3.1”项下色谱条件测定，重复进样（n=3），20 μL/次。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，做标准曲线，得到回归方程为：Y=561810X-412990，r=0.9999。结果显示钩藤碱在0.10～1.6 μg范围内呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验

精密吸取同一质量浓度对照品溶液20 μL，重复进样6次，测得峰面积的RSD为0.95 %。结果表明精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

取新制备的钩藤供试品溶液,分别在0、2、4、8、10、12分别进样20μL。按照钩藤碱对照品峰面积计算RSD为0.4%。表明供试品溶液中钩藤碱在12内稳定。

2.3.5 重复性试验

取新制备的钩藤供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件测定钩藤碱的含量,RSD为1.4%,表明重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

取已知钩藤碱（含量0.2232%）的钩藤药材供试品10份，每份约5.0g，分别精密称定；其中9份中每3份按80%、100%、120%水平加相应质量的钩藤碱，另一份做空白对照，制备供试品溶液，分别测定，计算加样回收率。结果平均回收率为98.02%，RSD为1.21%。

2.3.7 样品的测定

取供试品溶液，重复进样（n=3），按照“2.3.1”项下色谱条件测定钩藤碱的含量，测定结果按外标法计算。

2.4 试验结果

色谱图见图1，正交设计见表2，方差分析见表3。

方差分析可知，影响钩藤碱提取的主次因素为C＞B＞A,即乙醇的体积分数＞提取次数＞提取时间。方差分析可知，B因素和C因素为显著因素，A因素为不显著因素，即提取次数和体积分数对钩藤碱的提取有显著影响。最佳提取工艺为A3B3C3，即体积分数为90%的乙醇，提取时间3h，提取次数3次为最佳工艺。

2.5 验证试验

精密称取3份干燥的钩藤药材各20g，按最佳工艺进行平行操作，测得提取物中钩藤碱的平均含量为0.32%，与预测值接近，说明此方法可行。

3 讨论

（1）钩藤所含的有效成分为吲哚类生物碱，易溶于氯仿、丙酮、乙醇、苯等有机溶剂，难溶于水，因此采取提取后浓缩至无醇时,加水生成沉淀，除去其中的水溶性杂质。

（2）方差分析表明，提取次数和乙醇的体积分数是影响提取效果的显著因素，提取时间2h与3h的提取效果差别很小，而且要考虑到钩藤碱、异钩藤碱的热不稳定性^[5，6]，以及结合成本及时间问题。因此在工业生产中，可以选择90%乙醇，2h，3次的工艺条件。钩藤生物碱具有多种药理活性，尤其在降压方面有着良好的应用前景，该提取方法具有稳定性好、钩藤碱的得率高、操作简单、生产成本低等优点，适合于工业生产，为开发钩藤生物碱提供了参考。

参考文献：

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.2000 版（一部）.北京:化学工业出版社,2005.

［2］ 王群，李江疆．钩藤碱对心血管系统部分药理作用研究［J］．宁夏医学杂志，1998，20(5)：289-291．

［3］ 刘新民，于澍仁．钩藤的药理研究和临床应用进展［J］．基层中药杂志，1990，4(4)：27-28．

［4］ 孙秀华.几种药材提取方法评析［J］.西北药学杂志,1989,4(4):27.

［5］ 陈思莳，付春梅，李章万，等.毛细管电泳法测定钩藤中的钩藤碱［J］.华西药学杂志，2008，23（3）：355-356.

［6］ Tianjin Institute of Medicine．Study of Rhynchoph yJlines Extract and Pharmacist［J］．News of Chinese Herbal Medicine，1974,(4):8.

（责任编辑：陈涌涛）