抗菌抗病毒大黄素型蒽醌类成分提取分离技术的研究与应用

余玖霞　吴　超　丁　宁　李　锐　陈建伟

（1.南京中医药大学；2.南京中医药大学 江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京 210029）お

摘 要：经研究发现大黄素型蒽醌类化合物对细菌和病毒有明显的抑制作用。该类化合物的分离和提纯近年来取得了不少进展，发现了一些新技术、新工艺，使得提取、分离更加快速、有效。对国内外抗病毒大黄素型蒽醌类成分提取分离技术及其应用作一概述，并展望其开发应用前景。

关键词：大黄素型蒽醌衍生物；抗菌；抗病毒；提取分离技术

中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）01-0042-04

大黄素型蒽醌类衍生物通常呈黄色，系由C₁₅至C₁₆组成的由8单位的醋酸-丙二酸形成的多酮棕榈酸经闭环、脱羧生成的一类化合物。常见的有大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素（结构式如图1所示）。其羟基分布于两个苯环上，具有泻下作用^[1]。近年来发现的大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素等4种游离大黄素型蒽醌类化合物对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）均有较强的抑制生长作用，而大黄提取物（Rheum officilale extracts）有中等程度的抑制生长作用（见表1）^[2]。大黄蒽醌类化合物抗流感病毒的半数有效浓度（IC₅₀）为122.4μg/mL，治疗指数（TI）为1.9，且对流感病毒抑制作用存在明显的量效反应关系^[3]。Andersen DO等对多种蒽醌及其衍生物进行抗病毒筛选，结果显示，具有羟基和甲基取代的大黄素型蒽醌衍生物对膜病毒如：疱疹性口炎病毒、单纯疱疹病毒（HSV-1，2）、副流感病毒等均有抑制作用^[4]。另有研究表明，芦荟大黄素对带状疱疹病毒、假狂犬病毒、流感病毒有灭活作用。电镜复制检验发现，HSV膜受到部分破坏。因而提示了大黄蒽醌类对膜病毒有直接的杀灭作用。大黄素在光照影响下，对HSV-1显示较强的灭活作用，它的衍生物对人巨噬细胞病毒也有抑制作用^[5]。该类成分通常以游离或苷的形式存在于蓼科大黄属（rheum）、酸模属（Rumex）和蓼属（Polygonum），豆科决明属（Cassia）等植物中。有关大黄素型蒽醌类衍生物的分离纯化，除采用常规法外，近年来又出现了一些新技术，使得提取分离更加有效、快速。现就一些常规提取技术与新技术在大黄蒽醌类成分分离上的应用作一综述。

1 常规系统溶剂提取法

常规溶剂提取法是先用大量加热乙醇反复多次提取，减压浓缩后再用溶剂如苯、乙醚、戊醇、甲基丁酮或氯仿提取大黄中各种游离状态的蒽醌衍生物，残渣再以稀酸（硫酸或盐酸）和溶剂（苯或氯仿）水解提取，不但费时，而且要消耗大量溶剂。改进的常规系统溶剂提取法见图2^[6]。

2 新技术的应用

2.1 微波提取技术

微波萃取是利用微波来提高萃取率的一种最新发展起来的新技术。微波加热属内部加热过程，经过微波辐射后能富集药材中有效成分。具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分得率高的特点，被应用于中药及天然化合物的生物活性成分提取等方面。

郝守祝等比较了微波提取法与常规提取方法的提取效率，考察了微波输出功率、药材粒径、浸出时间对提取效率的影响，确定微波输出功率为480W，60目大黄粉，微波提取20 min后，其所得游离蒽醌的含量明显高于常规的水煎煮法，与95%乙醇回流提取法相当^[7]。沈岚等在研究微波提取时，以大黄中总蒽醌的含量为评价指标，从提取率与提取速度两方面进行了微波萃取与常用提取方法的比较研究，结果表明用微波萃取大黄 5 min的提取率已超过超声提取法 60 min的提取率，15 min已达到或接近索氏提取法2h和水煎法的提取效果^[8]。胡秀丽等研究了大黄总蒽醌的微波辅助提取、超声提取和索氏提取方法，并利用分光光度法测定了提取液中总蒽醌的含量。结果表明微波辅助提取法的提取率最高（达1.91%），是超声法的1.13倍，是索氏提取法的1.29倍^[9-10]。2.2 超声提取技术

超声波是一种弹性机械振动波，能破坏植物药材的细胞，使溶媒渗透到药材细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解，以提高有效成分的提取率。

超声技术已经广泛应用于陆地及海洋植物的药用成分的提取^[11]，如郭孝武用不同频率的超声波从大黄中提取大黄蒽醌类成分。与常规煎煮法提取相比，超声技术无需加热，且随超声波频率不同而得率不同，尤以频率为20 kHz的超声提取后，大黄蒽醌成分的得率最高^[12]。张海晖等采用正交试验设计法，以水为提取溶剂，发现采用超声波强化提取10min，对游离蒽醌的提取率即与水煎煮法煎煮60 min提取效果相当；并且以乙醇为提取溶剂的提取效果明显好于水，几种方法相比较，以乙醇作为提取溶剂的超声波萃取法对大黄蒽醌的提取效果最好，明显优于常规煎煮法和乙醇回流法^[13-14]。王佩琪等采用超声提取法以大黄游离蒽醌的提出率为目的，考察了提取时间、药材粒径、溶剂醇浓度3个因素，并经正交试验进行筛选，结果溶剂醇浓度对提取大黄游离蒽醌影响显著，反应时间和颗粒径数对提取大黄游离蒽醌的影响不显著；经与45%及95%乙醇加热回流法进行比较，超声法对大黄游离蒽醌的提取效率要明显优于乙醇加热回流提取法，说明超声提取法对中药活性成分的提取效率较高^[15]。李霞等以游离蒽醌得率为指标，探讨了超声波强化大黄蒽醌的双相水解工艺的主要因素；用正交实验优化了用超声波强化大黄蒽醌的双相水解工艺的工艺条件，实验表明影响游离蒽醌得率的主次因素为：提取温度>超声功率>硫酸体积分数>提取时间^[16]。

2.3 超临界CO₂流体萃取法

超临界流体萃取（简称SFE）是一种以超临界流体代替常规有机溶剂，对中药有效成分进行萃取和分离的新技术。具有萃取效率高和选择性高、省时、萃取溶剂易挥发、萃取物干净、对环境污染小、操作条件易改变的特点^[17]。萃取完成后，改变体系温度和压力，使超临界流体变成普通气体逸散出去。利用超临界CO₂流体（SCF）作溶剂，可以从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分^[18]。Tateo 等采用纤维素酶处理掌叶大黄后，常压下用乙醇进行提取，发现总蒽醌萃取率与酸水解相比有所提高。当操作条件位于临界点之上时，在夹带剂的存在下，CO₂就显出超临界状态的特性，对大黄蒽醌类物质具有较强的溶解能力，从而可以实现萃取分离^[19]。未作君等对大黄游离蒽醌的超临界萃取工艺进行了优化，当采用5mol•L^-1盐酸、2g•L^-1淀粉酶和1g•L^-1纤维素酶对大黄结合蒽醌进行水解时，大黄结合蒽醌的糖苷键达到最优水解，此时总蒽醌质量分数分别为2.46%、2.33%和2.23%^[20]。陈卫林等通过均匀设计试验确定了超临界二氧化碳流体萃取掌叶大黄中蒽醌类成分的最佳提取工艺条件是萃取压力为 38 MPa，萃取温度为70℃，萃取时间为 60 min，夹带剂用量为 300mL^[21]。郑志华等在研究大黄泻下作用时，对大黄有效成分进行了普通水提、醇提等，几种方式提取后，再将提取液过大孔树脂柱进行精制，在以上4种方法中，二氧化碳超临界萃取及提取液用树脂精制工艺泻下作用最强^[22]。刘玉敏等用正交设计法和方差分析考察影响超临界流体萃取大黄蒽醌的5个因素及最佳萃取条件，以优化SFE法提取工艺。当SFE最佳萃取温度为70°C、压力35 Mpa、甲醇剂量 0.6 L、静态萃取时间 8 min及动态萃取体积 5 mL时，可用于大黄蒽醌的提取分离^[23]。Pyo D认为，对于极性较弱的油脂类物质，采用少量的夹带剂甚至不采用夹带剂就能够很好地被超临界CO₂萃取出；但对于大黄游离蒽醌等强极性物质，夹带剂用量的多少则对改善大黄游离蒽醌在超临界CO₂中的溶解性能具有决定性的影响^[24]。

2.4 大孔树脂吸附分离法

大孔树脂是20世纪60年代发展起来的一种新型吸附剂，既有物理吸附作用，又因多孔状结构而有筛选作用。该吸附剂在中药有效成分分离提取的应用中，呈现出良好的发展势头^[25]。袁倚盛等用大孔树脂吸附法，使总蒽醌的含量达到50%以上，收率较高^[26]。金波等以大黄总蒽醌的提取率及洗脱率为考察指标，考察大黄的提取条件及大孔吸附树脂富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。通过大孔吸附树脂富集与纯化，用70%乙醇洗脱，总蒽醌的洗脱收率在80%以上^[27]。许汉林等比较了D301、AB-8、X-5、NKA-2、H1020型号的5种大孔树脂对大黄总蒽醌的吸附性能；以大黄总蒽醌中的代表成分大黄素为考察指标，结果D301树脂对大黄总蒽醌的吸附性能最佳^[28-29]。黄园等在研究大黄总蒽醌纯化工艺时，采用了4种方法（明胶沉淀法、醇调pH值法、聚酰胺法以及大孔吸附树脂法）对大黄提取液富集效果进行研究，结果表明大孔树脂对大黄总蒽醌的富集效果最好^[30]。王高森等以一个含有生物碱、蒽醌、皂苷等由黄连、大黄、知母等药材组成的中药复方为样品，采用4种型号（LD605，F95-34，F95-36，F95-37）大孔树脂进行吸附纯化工艺和特性研究。结果表明，上柱药液与上柱体积比以LD605型最高，可达10∶1，其余3种树脂体积比仅为LD605型的80%～90%。对比4种树脂的上柱量，分别以可溶性浸出物计、以大黄总蒽醌计，LD605型树脂最高^[31]。刘峰群等以D101型大孔吸附树脂分离大黄中结合型蒽醌提取物，加样吸附1h，以足够量水冲洗吸附柱，流速约1 mL•min^-1，至洗脱液几乎无色。改用50%的乙醇液冲洗，采用比色法考察总提取物中结合型蒽醌类物质的含量，总收率为87.6%^[32]。金汝城等对比5种大孔树脂对大黄总蒽醌的吸附性能，以大黄总蒽醌为考察指标，对大孔树脂吸附纯化大黄总蒽醌的条件进行了筛选。结果S-8型树脂对大黄总蒽醌适宜交换吸附条件为pH=9，流速为1 mL•min^-1，洗脱剂用5%氢氧化钠和95%乙醇混合液，解吸效果较好。静态交换容量为15.48 mg/g，动态交换容量为23.12 mL•g^-1，吸附率为92.01%，吸附性能较好^[33]。

2.5 离心薄层色谱分离法

离心薄层色谱法，又称离心液相色谱法（Centrifugal Liquid Chromatograph，简称CLC），其分离原理是根据试样在固定相和流动相之间的吸附、分配作用的不同，再加上离心加速度的作用，使试样中各组分之间原有的R璮值差异加大，从而提高了分离效果。洪美芳等采用该法从决明子中分离结构上极相似大黄酚和大黄素甲醚，只需1.5 h即能完成分离^[34]。

2.6 高速逆流色谱法

高速逆流色谱法（High-speedcounter-currentchromatography，简称HSCCC）是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的色谱法。逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱到现在的HSCCC历经数十年，技术和设备日臻成熟，可广泛应用于中药及天然药物的研发。有学者利用高速逆流色谱对传统中药大黄中的蒽醌类活性成分进行了制备分离研究，两相溶剂分离系统采用了氯仿：甲醇：水（4：3.8：2）溶剂系统，并对制备品进行了薄层色谱分析，检验了其中的大黄素，证实了其中的蒽醌类成分，说明了该方法的有效性和实用性^[35]。黄健光等利用高速逆流色谱，采用加入酸碱的方法对大黄中的蒽醌类活性成分进行了分离研究，实现了分离纯化过程一次完成；溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（体积比为9∶1∶5∶5），三氟乙酸作为保留酸，氨水作为洗脱碱；用高效液相色谱分析分离产物，证明得到了大黄蒽醌的五种纯物质，较之传统方法快速高效^[36]。Yang等利用乙醚-水的两相溶剂系统，通过调整流动相pH值，采用梯度洗脱，从大黄中分离了大黄酚、大黄素、大黄素甲醚等羟基蒽醌类化合物，纯度均大于98％^[37]。

2.7 毛细管电泳色谱技术

毛细管电泳（Capillary electrophoresis，简称CE）是近些年发展起来的一种常用于中药活性组分微分离分析的新技术。具有柱效高、分离速度快、毛细管清洗方便快捷等特点。宗玉英等采用胶束电动毛细管电泳（MECC）以25 mmol/L十二烷基磺酸钠（SDS）溶液中加入改性剂，在pH 10.96条件下分离测定了大黄素，芦荟中大黄素、大黄酸的含量，回收率分别为99.9%～101.9%、98.2%～101.8%和99.2%～101.2%^[38]。

3 前景与展望

大黄素型蒽醌类衍生物对多种病毒和细菌具有抑制和杀灭作用，尤其是具有较强的抑制幽门螺杆菌活性作用，临床显示有较好的疗效。新近应用的提取分离技术各有特点，可以快速分离、获得有效成分单体或进行准确的定量，超临界CO₂流体萃取法与酶制剂结合使用还可以实现蒽醌类提取物的工业化生产。因此，新的提取分离技术为大黄素型蒽醌成分的开发利用和质量控制开辟了广阔的应用前景。

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（责任编辑：陈涌涛）