他莫昔芬对人肝癌细胞增殖及凋亡的影响

林　松　江　平　乔建国

（武汉大学 中南医院，湖北 武汉 430071）お

摘 要：目的：研究他莫昔芬对人肝癌细胞Hep3B增殖、凋亡以及雌激素受体（ER）表达的影响。方法：按他莫昔芬浓度分别为7.5、15、30mol/L分为3组，对照组为空白培养基，每组设10个平行孔，每孔加入细胞浓度为1×105个/mL的细胞悬液0.1mL，分别培养24、48及72h。采用MTT法测定OD值，计算细胞增殖抑制率；用RT-PCR方法在mRNA水平检测p21WAF1以及流式细胞术来观察细胞凋亡情况；用免疫组化方法观察他莫昔芬对Hep3B细胞雌激素受体表达的影响。结果：他莫昔芬抑制人肝癌细胞Hep3B增殖（P<0.05），并随其浓度及处理时间的增加而抑制率增加；他莫昔芬提高细胞凋亡率；他莫昔芬抑制雌激素受体的表达（P<0.05），促进p21WAF的表达。结论：他莫昔芬通过影响肝癌细胞ER和p21WAF的表达抑制肝癌细胞增殖。

关键词：肝癌；他莫昔芬；雌激素受体；凋亡；p21WAF

中图分类号：R735.7文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）03-0007-03

他莫昔芬（tamoxifen，TAM）又称为三苯氧胺，为非甾体类雌激素受体拮抗剂，此前主要应用于成人乳腺癌的预防及治疗，在肝癌的治疗上有一定的疗效，但存在很多争议^[1]。本课题通过观察人肝癌细胞Hep3B细胞在他莫昔芬作用前后增殖活性和细胞凋亡情况的变化，雌激素受体（ER）阳性表达以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物（CKI）之一p21WAF基因水平表达的变化，来研究他莫昔芬在肝癌治疗中的可行性及可能的作用机制。

1 材料及方法

1.1 材料

人肝癌细胞Hep3B由武汉大学基础医学院病毒学研究所提供；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；试验用他莫昔芬，即用型鼠抗人ER单克隆抗体及MTT购自美国Sigma公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；青霉素购自华北制药公司；RT-PCR试验引物由上海生工合成，SP试剂盒及联苯二胺显色剂购自福州迈新生物技术公司。

1.2 方法

（1）细胞培养。将人肝癌细胞Hep3B细胞株常规培养于RPMI1640培养基中（加入10%胎牛血清及浓度为100U/mL的青霉素），置于37℃、5%CO₂培养箱中。

（2）分组。按他莫昔芬浓度为7.5、15、30μmol/L分为3组，对照组不加入他莫昔芬，每组设10个平行孔。

（3）MTT试验。取培养稳定的对数生长期Hep3B细胞，用1640培养基调节细胞浓度为1×105个/mL，加入96孔培养板，每孔加入0.1mL，置入37℃、5%CO₂培养箱中24h，镜下观察细胞大部分贴壁后，弃去培养液分别加入含不同浓度他莫昔芬的培养液每孔各0.1mL，继续培养24、48及72h，然后每孔加入MTT10μL，继续培养4h，弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振荡约15min，于492nm读取OD值，并计算抑制率。抑制率（%）=（1-试验孔OD值/对照孔OD值）×100%。

（4）ER免疫组化染色。将盖玻片置入六孔板的培养孔，取对数生长期的细胞传代后加入培养孔中，加入含不同浓度他莫昔芬的培养液，置入37℃、5%CO₂培养箱中培养24、48、72h后，将盖玻片放入4℃甲醇∶丙酮（1∶1）中约20min固定，用PBS液清洗玻片3×3min，甩干后于每张盖玻片上滴加50μL的非免疫性动物血清封闭，置入37℃温箱孵育30min。用SP法进行免疫组化染色，每张盖玻片上滴加50μL即用型鼠抗人雌激素受体单克隆抗体，4℃过夜，然后每孔加入50μL生物素标记的二抗，37℃孵育1h，每孔加入50μL链亲和素-过氧化物酶也即三抗，37℃孵育40min，每孔加入联苯二胺100μL显色，苏木素复染，1%盐酸乙醇分色，梯度浓度的乙醇液脱水干燥，二甲苯透明处理，最后用中性树胶封片。

（5）流式细胞仪检测。使用武汉大学基础医学院Beckmann流式细胞仪对样品进行检测。收集经不同浓度他莫昔芬作用24、48、72h的细胞，常规用胰蛋白酶消化，离心收集后用预冷的浓度为70%的乙醇液固定，-20℃过夜，100μLRNA酶（100mg/L）消化，常规PI（50mg/L）染色，4℃避光30min后上机检测，激发波长为488nm，分析结果后计算凋亡率。

（6）RT-PCR检测P21WAF1。收集经不同浓度他莫昔芬作用不同时间的细胞，经异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA。Oligo（dT）18为引物，逆转录合成cDNA，然后以合成的cDNA为模板，用P21基因及β-actin内参照进行半定量PCR扩增。实验条件为：变性94℃ 60s，退火60℃ 60s，延伸72℃ 60s，30个循环，P21基因扩增带为316bp，β-actin扩增带为500bp。引物序列：P21上游引物5-CCACATGGTCTTCCTCTGCTG-3，下游引物5-GATGTCCGTCAGAACCCATG-3；β-actin上游引物5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，下游引物5-CTCCTTAATGCACGCACGATTTC-3。

2 结果

2.1 他莫昔芬对人肝癌细胞增殖的影响

TAM对人肝癌细胞Hep3B的抑制作用随作用时间延长而不断增强，24、48、72h组之间相比差异均有统计学意义（P<0.05）；随TAM浓度增加作用也增强，不同浓度TAM组肝癌细胞抑制率均较对照组高（P<0.05），30μmol/L组72h抑制率最高，如表1所示。

2.2 他莫昔芬对人肝癌细胞ER阳性表达的影响

TAM对人肝癌细胞ER阳性表达的抑制作用随作用时间延长而不断增强，24、48、72h组ER阳性率下降并有统计学意义（P<0.05）；不同浓度TAM对ER阳性表达均有抑制作用，且随浓度增加抑制作用增强，各组肝癌细胞ER阳性率均较对照组明显降低（P<0.05），30μmol/L组72hER阳性率最低，如表2所示。

2.3 他莫昔芬对人肝癌细胞凋亡的影响

（1）流式细胞仪检测结果。肝癌细胞的凋亡率随TAM浓度的增加和作用时间的延长而提高。肝癌细胞生长阻滞于细胞周期的G0/G1期，S期比例减少，细胞增殖指数下降。与对照组比较各组均有统计学意义（P<0.05），如图1所示。

（2）RT-PCR检测结果。P21基因mRNA的表达在TAM作用24h后与对照组比较即有增加，并随TAM浓度的增高及作用时间的延长而表达进一步增高，30μmol/L组作用72h最为明显，与肝癌细胞凋亡过程基本一致，如图2所示。

3 讨论

肝癌是一种雌激素依赖型肿瘤，相关研究表明，雌激素水平的上调可导致肝癌发病率升高^[2]。人肝细胞表达高亲和性的ER，而肝癌细胞ER表达较正常肝细胞更高^[3]，雌激素通过ER介导的信号通路来诱导肝细胞基因转录水平的变化，从而诱导肝癌的发生^[4]。此外雌激素尚可通过激活蛋白激酶C来促进人肝癌细胞的增殖^[5]。

TAM为一种非甾体抗雌激素类药物，其化学结构与雌激素相似，故可在雌激素作用的各人体靶器官内与雌激素竞争ER，减少胞浆内的ER含量，阻止细胞核内雌激素生成基因的转录和ER的再合成。TAM还通过作用于信号传导MAPK通路，阻断蛋白激酶C，从而激活TGF-β、p21、p27等的表达来抑制肿瘤细胞的生长^[6]，目前已广泛应用于临床乳腺癌的预防及治疗。

然而将TAM应用于临床肝癌治疗目前尚存在争议。体外实验发现TAM对肝癌细胞增殖有抑制作用，呈时间-浓度依赖性^[7]。本研究发现，随着TAM浓度的增加和作用时间的延长，其对肝癌细胞Hep3B增殖的抑制作用不断增强，以浓度为30μmol/L的TAM作用72h的抑制作用最强，ER的阳性表达率最低，流式细胞仪检测显示细胞增殖指数最低，RT-PCR产物电泳显示p21基因mRNA表达水平最高。实验的结果说明TAM可以抑制肝癌细胞生长，它通过与雌激素竞争性结合ER，阻断蛋白激酶C，降低端粒酶活性^[8]，上调p21、p27的表达^[9]，影响Ca2+通路^[10]等来抑制肝癌细胞的增殖及促进其凋亡。

综上所述，相关研究证明，TAM对人肝癌细胞的增殖有抑制作用，这为TAM应用于临床肝癌的内分泌治疗提供了理论依据，而且因TAM价格较低，易于推广，故显示出了很好的应用前景。而雌激素水平对于TAM抑制肝癌细胞增殖的影响尚待进一步研究。

参考文献：

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［8］ BRANDT S， HELLER H， SCHUSTER KD， et al. The tamoxifen-in- duced suppression of telomerase activity in the human hepa- toblastoma cell line HepG2： a result of post-translational regulation［J］. J Cancer Res Clin Oncol， 2005，131（2）：1202128.

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（责任编辑：陈涌涛）