炮制方法对杜仲中绿原酸含量的影响

彭修娟　张亚强　宋小妹

摘 要:目的:探讨不同炮制方法对杜仲中绿原酸含量的影响。方法:采用HPLC法测定杜仲生品及6种不同炮制品中绿原酸的含量。结果:绿原酸的含量:盐蒸制>盐制砂炒2>盐制砂炒1>盐炒制2>盐炒制1>清炒>生品。结论:炮制方法对杜仲中绿原酸的含量有影响,且以盐蒸法较为理想。

关键词:杜仲;炮制方法;绿原酸

中图分类号:R283.3文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)06-0029-02

杜仲为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥树皮,为名贵中药材,始载于《神农本草经》,列为上品,具有补肝肾、强筋骨、安胎[1]之功效。杜仲皮含有多种活性成分[2],其中绿原酸(Chlorogenic Acid) 和松脂醇二葡萄糖苷(Pinores inoldiglucoside,PDG)有降压作用 [3,4]。本文以绿原酸含量为指标,比较各炮制方法对其含量的影响,为临床盐制杜仲提供科学的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Sartorius BP211D型电子分析天平(德国),FW177型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司),Waters2690高效液相色谱仪,Waters996二极管阵列检测器,Millennium32色谱工作站, H66025T型超声清洗仪。

1.2 试药

杜仲原药材购自西安市药材市场,经陕西中医学院中药教研室王继涛教授鉴定为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的干燥树皮。绿原酸对照品(购于中国药品生物制品检定所,批号:0753-200111)。流动相所用甲醇为色谱纯,水为重蒸水(实验室自制),盐水均为2%的食盐水溶液,磷酸等其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 不同炮制品的制备

杜仲生品的制备:将杜仲除去粗皮,洗净润透,用切药刀切成3～4mm的横丝(垂直于胶丝的生长方向)。

不同炮制品的制备:

清炒法:取100g杜仲丝置炒制容器内,中火炒至颜色加深,有焦斑,丝易断时,取出晾凉。

盐炒制1:取100g杜仲丝,置容器内加盐水拌匀,加盖闷润。待盐水被吸尽后,置炒制容器内,中火炒至颜色加深,有焦斑,丝易断时,取出晾凉。

盐炒制2:取100g杜仲丝,置炒制容器内,中火炒至颜色加深,有焦斑,丝易断时,取出,喷淋盐水拌匀,再置炒制容器内炒干,取出晾凉。

盐制砂炒1:将河砂置锅内炒至灵活状态后,取用盐水闷润好的杜仲丝100g倾入锅内,中火反复翻炒20min,取出晾凉。

盐制砂炒2:将专用温度计置入锅内,放入适量细砂,将100g杜仲丝置入锅内,中火反复翻炒20min后取出,筛去细砂,喷淋盐水拌匀,再置炒制容器内炒干,取出晾凉。

盐蒸制:取100g杜仲丝,置容器内加盐水拌匀,加盖闷润。待盐水被吸尽后,置锅内中火蒸制1h,取出晾凉。

2.2 色谱条件

色谱柱:Welch Materials C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-0.4%磷酸溶液(25∶75);柱温:25℃;检测波长:327nm;流速:1mL•min-1;进样量:10μL。

2.3 对照品溶液的制备

取绿原酸对照品,精密称定,加甲醇溶解、定容,制成每1mL含绿原酸0.406mg的对照品溶液,备用。

2.4 供试品溶液的制备

取上述不同炮制品粉末各1g,精密称定,置于三角瓶内,精密加入甲醇25mL,称重,超声1h,取出,用甲醇补足缺失量,滤过,取续滤液作为供试品溶液。

2.5 线性关系考察

精密吸取绿原酸对照品溶液1mL,置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取8、10、12、14、16、18、20μL,按2.2项下的色谱条件测定。以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,得回归方程为:Y=3174278.9899X+1505.6609(r=0.9996),结果显示,绿原酸对照品在0.324～0.812μg范围内线性关系良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液,按上述色谱条件,分别于0、2、4、6、8、10、12h进样10μL,测定绿原酸的峰面积。结果表明,供试样品在12h内峰面积稳定,RSD 为1.62%。

2.7 精密度试验

取同一供试品溶液10μL,按上述色谱条件,连续进样5次,测定绿原酸的峰面积。结果表明,精密度良好,RSD为 0.97%。

2.8 重复性试验

取同一样品共5份,照“供试品溶液制备”项下的方法制备供试品溶液,按上述色谱条件,测定绿原酸的峰面积。结果表明,本方法重复性良好,RSD为0.59%。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品6份,精密加入一定量的绿原酸对照溶液,照“供试品溶液制备”项下的方法制备供试品溶液,按上述色谱条件,取10μL注入液相色谱仪,测定绿原酸的峰面积,计算回收率。结果表明,绿原酸的平均回收率为99.92%,RSD为1.68%。结果见表1。

2.10 样品的含量测定

分别吸取各供试品溶液10μL,注入液相色谱仪,按2.2项下的色谱条件测定,记录峰面积,由回归方程计算绿原酸的含量,结果见表2,对照品及样品HPLC色谱图见图1。

结果表明:不同炮制样品中,绿原酸含量:盐蒸制>盐制砂炒2>盐炒制2>盐制砂炒1>盐炒制1>清炒>生品。

3 讨论

(1)流动相的选择,通过对乙腈-不同浓度磷酸溶液系统,及其乙腈-磷酸溶液不同比例的洗脱系统进行考察,最终选择甲醇-0.4%磷酸溶液(25∶75)出峰较为理想,可达到基线分离。

(2)对于检测波长的选择,进行了全波长扫描,绿原酸选用327nm,系统稳定性好,干扰小。

(3)通过对不同炮制方法对杜仲中有效成分影响的实验研究,结果表明,生品的绿原酸含量明显低于各炮制品,这可能是由于生品杜仲中橡胶丝的作用使其有效成分难以溶出,这为传统的“炒断丝”炮制标准提供了理论依据。

(4)盐制杜仲中绿原酸的含量普遍高于清炒法和生品,这为盐制入肾的传统用药理论提供了科学依据。

(5)通过对不同盐制杜仲方法的比较,结果表明,砂炒杜仲中绿原酸的含量高于不加砂的炮制方法,这可能是由于砂可以提高炒制温度,传热也比较均匀,进而提高了杜仲的断丝率所致。

(6)盐蒸制杜仲中绿原酸的含量最高,但是否优于传统的炒制法,还有待于进一步研究。

参考文献:

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2005.

[2] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1996:286.

[3] CHARLES J SIH, RAVIKUMAR P, HUANG FUCHIN,et al. Separation and Synthesis of pinoresinol diglucoside moides olive[J].J Am Chem Soc,1976(17):5412.

[4] 李家实.杜仲皮与叶化学成分初步研究[J].中药通报,1986,11(8):41.

[5] 臧友维.杜仲化学成分研究进展[J].中草药,1989,20(4):42-43.

(责任编辑:曾楚华)

The Influence of Different Process Technics on the

Contents of Chlorogenic Acid in Eucommia Ulmoides Oliv

Abstract:Objective:To evaluate the influence of different process technics on the contents of Chlorogenic Acid in Eucommia ulmoides Oliv. Methods:The determination of Chlorogenic Acid in raw products and 6 kinds of different processed products of Eucommia ulmoides Oliv was performed by HPLC.Result and Conclusions:Different process technics had a remendous influence on the content of Chlorogenic Acid in Eucommia ulmoides Oliv.And the traditional process technic of Salt-steaming Method.

Key words:Eucommia Ulmoides Oliv;Process Technics;Chlorogenic Acid