山茱萸炮制增效活性部位对老年小鼠骨髓细胞ＭＮ影响的研究

王明艳　江励华　赵凤鸣　李　育　蔡宝昌

摘 要:目的:探讨山茱萸炮制增效活性部位对老年小鼠骨髓细胞微核(MN)的影响。方法:取青年组、老年组、用药组(山茱萸制品几种溶剂萃取部位)小鼠的骨髓细胞,检测MN,统计微核率。结果:老年组与青年组相比,微核率差异显著,而两个用药组分别用石油醚萃取部位、水煎液灌胃,小鼠骨髓细胞微核率与老年组相比差异显著,表现出一定的药效。结论:山茱萸制品水煎液及山茱萸制品石油醚萃取部位对老年小鼠骨髓细胞DNA有一定的保护作用。

关键词:山茱萸;老年小鼠;骨髓;MN

中图分类号:R283.1文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)06-0007-02

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)的干燥成熟果肉。其味酸、涩,微温,归肝肾经,临床常用的饮片有山萸肉、酒山萸肉。山茱萸酒蒸后化学成分发生了变化,药性和临床疗效也发生了很大的变化,其中补益肝肾作用明显增强。

本课题组完成了“十五”国家科技攻关计划“山茱萸炮制机理研究”,筛选出了山茱萸炮制增效活性部位(石油醚萃取部位、正丁醇萃取部位、醇沉多糖部位等)、活性成分(5-羟甲基糠醛、维生素E等),在此基础上,根据中医补肝肾理论和现代抗衰老理论,对山茱萸炮制增效活性部位及其成分进行进一步抗衰老研究,本实验观察山茱萸炮制增效活性部位对老年小鼠骨髓细胞MN的影响,初步探讨山茱萸炮制增效活性部位延缓老年小鼠衰老的作用,为临床研究提供微观实验依据,同时为进一步开发利用山茱萸这一名贵中药奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验药材

山茱萸生品购自河南省西峡县,经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为山茱萸(Cornus officinalis Sieb et Zucc.)的干燥成熟果肉,其炮制品由南京中药饮片厂依据药典2000版炮制。

1.2 实验动物

老龄ICR小鼠,15月龄,40～50g;青年小鼠,3月龄,18～22g,由南京医科大学实验动物中心提供,许可证:SCXK(苏2002-0031)。

2 实验方法

2.1 山茱萸溶剂萃取部位的制备

取一定量的山茱萸酒蒸品,用10倍量95%乙醇回流提取1.5h,趁热抽滤,药渣加10倍量50%乙醇回流提取1.5h,趁热抽滤,药渣加10倍量蒸馏水回流提取1.5h,趁热抽滤,合并滤液,60℃旋转蒸发浓缩制成浸膏,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,萃取物进行回旋浓缩,其中石油醚、正丁醇溶剂萃取部位用吐温-80∶植物油∶水=1∶1∶8配成乳剂在本实验中备用。

取一定量山茱萸酒蒸品粗粉(过20目筛,去核),加蒸馏水提取1.5h,抽滤,滤液加无水乙醇至醇浓度为80%(V∕V),醇沉,过夜,抽滤,然后收集醇沉粗多糖部位,于50℃真空干燥至恒重,精密称定多糖的重量,用蒸馏水配成一定浓度的溶液备用。

取一定量山茱萸酒蒸品加适量水浸泡2h,加热煮沸30min,滤出头煎,药渣加水适量,煮沸30min,滤出2煎,将2次滤液合并,加热浓缩至一定体积备用。

2.2 分组与给药

取青年小鼠12只,作为青年对照组;11月龄老龄小鼠60只,常规饲养至15月龄,随机分为5组,分别为老年组和4个用药组,均行灌胃给药,1次/d,连续30d,给药剂量根据前期实验结果选择、确定,如表1所示。

2.3 MN检测

小鼠骨髓细胞微核(MN)实验:颈椎脱臼处死小鼠,取骨髓细胞置生理盐水中,离心,去上清液;加37℃预温的0.4%KCl 3mL,置37℃下8min,离心,去上清液;加固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1mL预固定,1000转/min条件下离心8min,去上清液;再加固定液4mL混匀,固定两次后气干法滴片,Giemsa(1∶10,pH6.4)染色8min。每个标本观察1000个细胞,每组共观察5000个细胞,计算出微核率,并进行统计学处理。

3 实验结果与讨论

小鼠骨髓细胞微核(MN)实验结果见表2。

由表2可见:每组观察5000个细胞,老年组与青年组相比,微核率明显升高,4个用药组与老年组相比,石油醚萃取部位和水煎液组微核率显著下降,P<0.05,反映了药物的保护作用。其它药物组差异不明显。

微核(Micronucleus)检测是检测诱变剂和抗变剂灵敏而且可靠的细胞整体检测方法。细胞受化学诱变剂作用后,

染色体受损伤而发生断裂,丧失着丝点的染色体断片或染色单体断片在细胞有丝分裂后期,遗落在细胞质中,末期后单独形成1个至几个小核,即微核。微核的形成反映了染色体受损情况。

遗传程序说和错误积累学认为:老化是DNA分子损伤、未得以修复或错误积累的直接后果。许多学者证实:DNA损伤或DNA损伤修复能力的减弱将加速衰老的进程。提高机体抗DNA损伤或提高其对DNA损伤修复的能力将延缓衰老。

本研究结果表明:老年组小鼠微核率较青年组高,反映了DNA的损伤情况,石油醚萃取部位和水煎液组情况有所改善。前期其它实验表明:山茱萸石油醚萃取部位和山茱萸水煎液有延缓衰老作用。本实验提示:其抗衰老作用可能与提高机体抗DNA损伤或提高对DNA损伤修复的能力有关。本研究为进一步深入开展山茱萸活性成分抗衰老研究提供了线索。

参考文献:

[1] 王明艳,蔡宝昌.山茱萸及其活性成分的药效研究概述[J].中华中医药学刊,2008,26(7):1419-1421.

[2] WEIFENG DU, HAO CAI, MINGYAN WANG et al,Simultaneous determination of six active components in crude and processed Fructus Corni by high performance liquid chromatography[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2008(48):194-197.

[3] 丁霞,王明艳,蔡宝昌.山茱萸中5-羟甲基糠醛的分离提取及生物活性研究[J].中国中药杂志,2008(4).

[4] 杨同华.中药抗化疗药物所致骨髓抑制实验研究概述[J].中国中西医结合杂志,1999,19(8):506-508.

(责任编辑:陈涌涛)