A型肉毒素对大鼠皮肤中神经肽SP、CGRP及创面组织表达TGF-β1和α－SMA的影响

王琳 邰宁正 陈蕊 范志宏

A型肉毒素对大鼠皮肤中神经肽SP、CGRP及创面组织表达TGF-β1和α－SMA的影响

王琳 邰宁正 陈蕊 范志宏

目的研究A型肉毒素（BTA）对皮肤神经末梢释放的神经肽SP、CGRP的影响及其对皮肤创伤愈合的意义。方法40只SD大鼠随机分为C组(空白对照组)和E组(肉毒素注射组)，20只/组。肉毒素A预注射后7 d，在鼠背部建立以4个注射点为中心的创面模型，面积1 cm×1 cm。测量术后3 d和7 d的创面面积。实时定量PCR（Real-time PCR）检测BTA注射后第7天（术前）和创面愈合后（术后14 d）的皮肤组织中感觉神经肽P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）以及创伤愈合中的重要分子TGF-β1和α－SMA的mRNA表达。结合免疫组化和图像分析技术检测切片中上述4种物质阳性染色的积分光密度OD值。结果①各组创面于术后14 d基本愈合。与C组相比，E组术后3 d、7 d的创面面积无差异（P＞0.05）；②E组术前和术后14 d的皮肤组织中SP、CGRP、TGF-β1和α－SMA的mRNA表达和OD值较C组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论①局部皮下注射BTA不影响创面愈合的时间和速度；②BTA能减少创面愈合过程中皮肤神经末梢对SP、CGRP的释放和创面愈合过程中TGF-β1和α－SMA的表达。

肉毒素AP物质降钙素基因相关肽创面愈合瘢痕

感觉神经末梢及其释放的P物质（Substance P， SP）和降钙素基因相关肽（Calcitionin gene-related peptide，CGRP）具有重要的促创伤愈合作用[1]，能上调成纤维细胞表达转移生长因子β1（Transforming growth factor beta-1，TGF-β1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth musle actin A，α-SMA），但这种作用的过度持续将导致瘢痕增生[2-3]。近年来，对肉毒素A（Botulinum toxin type A，BTA）镇痛机理的深入研究发现，它可以抑制感觉神经末梢释放SP和CGRP[4]。但BTA是否对创伤愈合过程中神经末梢释放的SP和CGRP具有相似的抑制作用，尚未见报道。

本实验通过局部皮下注射BTA预先封闭大鼠皮肤内的神经末梢，建立全层皮肤缺损的创伤模型，观察创伤愈合后皮肤组织中SP、CGRP和瘢痕增生挛缩中的标志性分子TGF-β1、α－SMA的表达，分析BTA对这些分子表达的影响、原理及意义，探讨应用BTA改善创面愈合、防治瘢痕增生挛缩的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验分组与大鼠创伤模型的建立

健康雄性SD大鼠（由上海交通大学医学院动物中心提供）40只，300 g左右。随机分为2组，20只/组。10%硫化钠背部脱毛。2 d后，称重，3%戊巴比妥按1 mL/kg腹腔给药麻醉。于鼠背部描画出4个1 cm×1 cm的正方形边界，1－0丝线缝合标记正方形对角线上两点并于此两点的中点，即正方形的中心处皮下注射肉毒A。C组，空白对照组；E组，A型肉毒素注射组，2 U/创面（图1）。7 d后，切除标记范围内的1 cm×1 cm全层皮肤，建立创伤模型。创面止血，凡士林纱布、无菌敷料包扎。

图1 大鼠背部创伤模型设计图

1.2 实时定量PCR（Real-time PCR）

分别于BTA注射后第7天（术前）和创面愈合后（术后14 d）取各创面1/2的皮肤组织，real-time PCR检测SP、CGRP、TGF-β1和α－SMA的mRNA含量。RNA提取试剂盒和Taq酶（RNeasy Mini Kit，Qiagen），RT逆转录试剂盒（Sensiscript RT Kit，Applied Biosystems）和逆转录试剂（SYBR Green Master Mix，Applied Biosystems）（大连宝生物公司）。ABI PRISM 7900 Real Time PCR测序仪（Applied Biosystems）。实验步骤及方法见参考文献[5]。4种物质的引物由计算机辅助设计，由上海生工生物公司合成。各物质及内参照物GAPDH(甘油醛磷酸脱氢酶)的引物序列如下:

1.3 免疫组化和Axioplan 2 Imaging图像分析

术后3 d和7 d，大体观察创面状况，透明塑料薄膜覆盖伤口，勾勒伤口形状，以Axioplan 2 Imaging图像分析软件计算创面面积。术前和术后14 d，采集各创面1/2的皮肤组织留做real-time PCR后，4%多聚甲醛灌注2组实验鼠，10只/组·时间点，切取另1/2的皮肤组织，留送免疫组化（抗体均购自Sigma公司），检测皮肤中SP、CGRP、TGF-β1和α－SMA的表达。每个指标10张切片/组·时间点，所有切片均在同一放大倍数（400×）、同一光强度下测量，3个视野/切片，Axioplan 2 Imaging图像分析软件测量各指标阳性染色的积分光密度（OD值）。

1.4 统计分析

想客人之所想，急客人之所急，往往是企业树立良好形象的关键。恰到好处的个性化服务能使顾客真切感受到酒店的关怀，体会到酒店以顾客利益为重，这样友好、周到的酒店形象便可深入人心。

所有数据以X±S表示，采用SAS6.12统计软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 肉毒素A对创面愈合时间和速度的影响

肉毒素A注射后，E组大鼠出现1 d的进食减少，但无行动障碍。创面愈合情况良好，伤后3 d时，创面内肉芽组织鲜红，分泌物较少；伤后10 d，创面已明显收缩；伤后14d，创面已基本愈合。E组术后3 d、7 d的创面面积与C组相比差异无统计学意义（表1）。

表1 两组术后3 d和7 d时创面面积(mm2)的比较

2.2 术前和术后14 d时皮肤标本中4种物质的mRNA含量

同一时间点下，E组各物质的mRNA含量较C组显著降低，差异有统计学意义，P＜0.05（表2）。

表2 皮肤标本组织中4种物质的mRNA含量

2.3 各组术前和术后14d时皮肤标本中4种物质的阳性染色OD值

术前（BTA注射后7 d）和术后14 d（创面愈合后）的皮肤切片中，SP和CGRP在大鼠皮肤中的分布基本相似，位于表皮基底细胞层、真皮乳头层、小血管膜及周围（图2、3）。TGF-β1分布广泛，且在愈后皮肤中的表皮真皮交界处表达较多。术后14 d的皮肤切片中，可见α-SMA在成纤维细胞胞浆中呈棕黄色阳性染色（图4、5）。

图2 术后14 d，C组皮肤内SP的表达及分布(200×)

图3 术后14 d，E组皮肤内SP的表达及分布(200×)

图4 术后14 d，C组皮肤内α-SMA的表达及分布(200×)

图5 术后14 d，E组皮肤内α-SMA的表达及分布(200×)

表3 皮肤标本组织中4种物质的阳性染色OD值

3 讨论

BTA是一种神经毒素。近年来，对BTA镇痛机理的深入研究发现：通过胞饮作用以及与突触前受体序列（Arrays of presynaptic receptors，APR）和突触囊泡蛋白（Synaptic vesicle protein，SVP）2A、B、C的结合，BTA还能直接作用于非胆碱能神经元和感觉神经末梢，缓慢持续地抑制SP、CGRP释放[5－7]。SP和CGRP是神经肽（Neuropeptide，NP）的代表物质，在皮肤中主要分布在感觉神经末梢。皮肤创伤时，感觉神经末梢受刺激释放SP和CGRP，启动神经源性炎症反应，通过与血管内皮细胞和免疫细胞表面的NK受体结合，发挥扩张血管、诱发免疫应答活性，促进创伤愈合。二者还能促进FB的生长增殖，上调TGF-β1mRNA表达，并与TGF-β1等细胞因子协同作用，促进FB向肌成纤维细胞（Myofibroblast, MFB）分化及α-SMA的表达[8]，促进伤口收缩，而辣椒素预处理的大鼠肉芽组织中SP、CGRP和α-SMA表达均减少，创面延迟愈合[3]。此外，创伤过度愈合所致的瘢痕增生、挛缩、瘢痕瘙痒与二者的持续过量表达关系密切[9-10]。

本实验发现，在BTA预处理的大鼠创伤模型中，两组的创面的愈合时间和愈合速度无显著差异。同一时间点下，两组SP、CGRP、TGF-β1和α-SMA的mRNA表达和免疫组化OD值有显著差异，且E组小于C组。说明创伤刺激了上述4种物质的分泌和合成，而BTA对此有明显的抑制作用。与辣椒素对神经肽的耗竭或其他化学物质毁损神经末梢所致的4种物质分泌合成不足、肉芽组织发育不良，创面收缩减慢不同，BTA预处理的大鼠皮肤创面不仅具有正常的愈合进程，并且愈合皮肤中SP、CGRP、TGF-β1和α－SMA的基因含量和蛋白表达显著减少。这可能是由于创缘皮肤内的神经末梢中仍残留少量未被BTA降解的突触小体相关蛋白（Synaptosomal associated protein，molecular mass 25 kDa，SNAP-25），或创伤刺激后，感觉神经末梢适应性地新合成了少量的SNAP-25，形成突触融合复合体，“复活”了部分突触囊泡与神经膜的融合，释放少量SP、CGRP，“部分”启动了创伤后的神经源炎性反应。E组中TGF-β1和α-SMA的表达减少，提示BTA可能对瘢痕的增生挛缩有抑制作用，但是否可以作为临床治疗的有效手段仍需进一步研究。

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Effect of Botulinum Toxin Type A on the Expression of Substance P,Calcitionin Gene-Related Peptide,TGF-β1 and α-Smooth Muscle Actin a in Wound Healing in Rats

WANG Lin,TAI Ningzheng,CHEN Rui,FAN Zhihong.
Plastic and Cosmetic Department,Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 20001,China. Corresponding author:FAN Zhihong.

ObjectiveTo investigate the effect of botulinum toxin type A on the expression of substance P and calcitionin gene-related peptide in wound healing.MethodsForty rats were randomly divided into Group C(Control)and Group E (Experimental),20 rats in each group.The wound-healing model was established by excised four full-thickness skin (1 cm×1 cm,circled the injection site)in the back of all SD rats 7 days after BTA injection.The area of wound was measured and calculated at the 3rdd and 7thday after skin lesion by computerized image analysis.On 0 and 14 days after operation,the content of substance P,calcitionin gene-related peptide,TGF-β1 and α－SMA were assayed by real-time polymerase chain reaction technique.The immunohistochemical staining and computerized image analysis were used to detect the OD value of positive staining of four substances.ResultsThe wounds in all groups healed at 14 days after operation and the area in Group E had no significant difference with that of Group C at 3 days and 7 days after operation.The positive immuno-staining of SP,CGRP,TGF-β1 and α－SMA in Group E were significantly weaker than those in Group C.ConclusionBotulinum toxin type A can decrease the expression of SP,CGRP,TGF-β1 and α－SMA in wound healing in dose-dependent manner without delaying the healing time.

Botulinum toxin type A;Substance P;Calcitionin gene-related peptide;Wound healing;Scar

R619+.6

A

1673－0364（2009）04－0202－04

2009年4月12日；

2009年5月28日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.006

上海市科委资助项目（074119606）。

200127上海市上海交通大学医学院附属仁济医院整形外科。

范志宏。