转染NF-1基因对人增生性瘢痕成纤维细胞胶原表达的影响

郑江红 邓辰亮 丁 志 茅广宇 杨松林

转染NF-1基因对人增生性瘢痕成纤维细胞胶原表达的影响

郑江红 邓辰亮 丁 志 茅广宇 杨松林

目的探讨重组NF1基因转染人增生性瘢痕成纤维细胞的可行性，以及转染NF1基因对细胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法体外重组NF1基因，借助真核表达载体系统，转入体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞，通过激光共聚焦显微镜观察报告基因表达，并确定细胞转染效率。应用Real time PCR法比较转染前后NF1 mRNA及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达；采用CCK-8比色法，比较转染细胞与未转染细胞增殖状况。结果基因转染后，约50%的被转染细胞表达绿色荧光；NF1 mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为：7.27±1.16，2.01±0.38，1.87±0.29，转染组NF1 mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组明显增高（P＜0.01，n＝5）；Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为：3.01±0.48和2.05±0.25，0.89±0.18和0.94±0.16，0.99±0.11和0.92±0.19；转染组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组均明显增高（P＜0.01，n＝5）。结论瘢痕成纤维细胞可作为NF1转染的靶细胞，NF1基因可能是导致瘢痕异常增生的重要基因。

细胞核因子1转染增生性瘢痕成纤维细胞

增生性瘢痕的病理表现为成纤维细胞过度增殖，炎性细胞浸润以及长时间的胶原过量合成。细胞核因子1（Nuclear factor-1，NF1）作为细胞转录因子，在调控增生性瘢痕细胞外基质表达的过程中扮演着关键的角色[1-2]。有学者在研究中发现，增生性瘢痕组织中NF1的表达明显高于正常真皮成纤维细胞[3]。为进一步研究NF1基因在增生性瘢痕细胞中的作用，本实验拟通过转染NF1基因进入人增生性瘢痕成纤维细胞，探讨NF1转染瘢痕成纤维细胞的可行性和转染NF1基因对细胞增殖速率以及Ⅰ、Ⅲ型胶原合成造成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌Top 10，高效真核表达载体pcDNA 3.0（Invitrogen公司，美国）；DMEM培养基、胰蛋白酶(Gibco公司，美国)；胎牛血清(Hyclone公司，美国)；胶原酶NB 4(Serva公司，德国)；脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)；PCR引物由上海生物工程公司合成；TRIzol RNA抽提试剂盒(GibcoBRL)；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒、SYBPremix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)；GeneRulerTM1 kb DNA Ladder(Fermentas，立陶宛)；激光共聚焦显微镜(Leica，德国)；ABI 7300 Real time PCR扩增仪(ABI，美国)；GIS 22800型凝胶图像处理系统(上海天能科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 NF1真核表达载体构建与鉴定

目的基因NF1 cDNA片段由RT-PCR方法获取。PCR扩增引物Full length-F:5′AGCAGGCAGCAGAGTGTGG3′，Full length-R:5′TGGAAGGGAAAGCCGGAAC3′；PCR条件为：模板2 μL，PCR缓冲液5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，dNT 4 μL，H2O 36 μL。94℃(4 min)经94℃(30 s)68℃(2.5 min)35个循环后，68℃延伸10 min。产物长度为3 123 bp。PCR纯化产物装入克隆载体PMD 18-T，大肠杆菌Top 10在LB固体培养皿上涂片培养，经蓝白斑筛选挑取单个白色菌落在含氨苄青霉素的LB培养液中扩增。用HindⅢ和XbaⅠ双酶切TA载体回收目的片段，表达载体pcDNA 3.0用HindⅢ和XbaⅠ双酶切回收线性载体，两者用T4连接酶连接构建pcDNA-NF1，经酶切电泳鉴定。

1.2.2 细胞培养与分组

增生性瘢痕标本来源于上海交通大学医学院附属第六人民医院门诊患者。无菌条件下切取标本，以0.5%氯霉素冲洗标本并浸泡10 min，将标本剪碎至1～2 mm3大小，0.3%NB 4复合胶原酶，37°C摇床消化3 h，150目滤网收集过滤液，1 500 r/min离心10 min，收集细胞，按2×104cells/cm2接种于培养皿，24 h后首次换液。准备传代，转染。分组：未转染正常组、转染空载体pcDNA 3.0组和pcDNA 3.0-NF1转染组。

1.2.3 细胞转染

细胞转染前24 h，按2×105个/孔的密度接种于6孔板中，细胞生长至30%～45%融合时转染质粒。方法：取无血清DMEM培养液240 μL与10 μL Lipofectamine 2000混匀，另取240 μL DMEM培养液与10 μL（100 pmol）质粒混匀，5 min后分别合并脂质体和质粒两液，室温下放置20 min。吸掉培养液，以每孔1.5 mL添加纯DMEM培养基，再加入脂质体质粒液，37℃培养5 h后，弃转染液，换10%FBS的DMEM培养液培养。

1.2.4 Real time PCR检测

分别收集对数生长期的未转染正常组细胞、转染空载体pcDNA 3.0和NF1转染组的细胞，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量后，行逆转录反应（RT）：取总RNA 1 μg，oligo dT 1 μL（0.5 μg），补足DEPC处理的ddH2O至13 μL，65℃变性5 min，立即置冰浴，再加RNase抑制剂20 U，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，5倍逆转录酶缓冲液4 μL，M-MLV逆转录酶200 U 2μL，总体积20 μL。反应程序：25℃反应15 min，37℃反应1 h，95℃反应5 min，终止反应后，RT产物行Real time PCR法检测NOS、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达。根据人NF1基因、Ⅰ、Ⅲ型胶原基因序列，设计上、下游引物序列为：NF1-F 5′TTCACAGACTGGCGTGGTCT 3′，NF1-R 5′GAGGT-GTACCCTGTCATGAT 3′；Collagen I-F 5′GAACGCG-TGTCATCCCTTGT 3′，Collagen I-R 5′GAACGAG-GTAGTCTTTCAGCAACA 3′；CollagenⅢ-F 5′AA-CACGCAAGGCTGTGAGACT 3′，CollagenⅢ-R 5′GCCAACGTCCACACCAAATT 3′。RT产物稀释10倍后取1 μL作为模板，加入2倍SYBPremix Ex TaqTM12.5 μL，上游引物、下游引物(10 pmol)各1 μL，ddH2O补足体积到25 μL。反应条件：50℃2 min，95℃变性15 min后，95℃15 s，60℃1 min，40个循环。

1.2.5 细胞增殖检测

以未转染细胞为例，当细胞生长至70%融合时，收集、接种于96孔板中（2 000个/孔），加入10 μL CCK-8溶液，培养箱内孵育3 h，酶标仪测A450吸光度，每组重复3次，绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 NF1基因克隆及表达载体构建

利用RT-PCR成功扩增了NF1基因全长，约3.1 kb(图1)。载体在2%琼脂糖凝胶中可见约8.5 kb DNA带，与预期质粒大小结果相一致，用HindⅢ和XbaⅠ双酶切电泳，在同一泳道中出现2条DNA带，1条为5.4 kb，与空质粒DNA链长度一致，确定为质粒DNA带；另1条约3.1 kb，与NF1 cDNA片段大小一致（图1）。基因测序后，证实所合成基因序列与基因库中一致率为99.95%。

图1 NF1克隆基因PCR产物及重组pcDNA 3.0-NF1质粒酶切电泳分析

2.2 瘢痕细胞NF1转染绿色荧光蛋白报告基因的观察

瘢痕细胞被转染，在细胞浆内可见绿色荧光表达，瘢痕细胞被转染48 h后，约50%细胞表达绿色荧光（图2）。

图2 绿色荧光蛋白报告基因的观察示瘢痕细胞被转染，在细胞内可见绿色荧光表达

图3 NF1 mRNA在各实验组细胞中的表达

2.3 Real time PCR检测NF1 mRNA表达

转染24 h后，Real time PCR检测到NF1 mRNA在转染组、转染空载体组和未转染组细胞中的表达分别为：7.27±0.93、2.01±0.22和1.87±0.21，转染组NF1 mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组明显增高（P＜0.01，n＝5）而未转染组和转染空载体组比较，无统计学差异（P＞0.05，n＝5，图3）。

2.4 NF1转染后对细胞增殖的影响

NF1基因转染后，被转染细胞的增殖与未转染和转染空载体细胞比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

2.5 NF1转染后对细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在转染组、转染空载体组和未转染组细胞中的表达分别为：3.01±0.37和2.05±0.28，0.89±0.17和0.94±0.18，0.99±0.14和0.92±0.16。转染组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA相对表达量较未转染组和转染空载体组均明显增高（P＜0.01，n＝5，图5）。

图4 CCK-8比色法测生长曲线

图5 Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA在各组细胞中的表达

3 讨论

目前关于增生性瘢痕的病因及发病机制，尚未被完全阐明。已有研究发现，瘢痕组织中的胶原及细胞外基质（ECM）的代谢异常，是增生性瘢痕形成的重要原因之一，并且NF1在其中起重要作用[4-5]。NF1是保持组织特异性基因正确表达的一种重要转录因子，其特异结合启动子区GC盒，激活增殖、凋亡、分化等有关基因转录[6－7]。在增生性瘢痕的局部组织中，NF1合成量增多，这提示NF1可能与瘢痕组织中ECM过量沉积有关[7]。因此，我们在研究中直接以瘢痕成纤维细胞为研究对象。为了进一步研究了解NF1在导致病理性瘢痕组织中细胞外基质增多中的作用，我们设计了先构建NF1基因再进行细胞转染的研究方案，并采用广泛应用的真核表达载体，该方法保证了研究结果的可靠性。

重组的NF1基因转入体外培养的瘢痕成纤维细胞后，转染的NF1转录因子是否在成纤维细胞中有效表达，是判断NF1基因转染成功与否的关键。我们采用激光共聚焦显微镜观察和相对精确的Real time PCR方法相结合[8－9]，发现了部分瘢痕成纤维细胞表达绿色荧光报告基因，而且转染后的细胞NF1 mRNA表达明显高于对照细胞。这些结果提示，NF1基因已被成功转入细胞内并且开始表达。本实验结果表明，当细胞被导入NF1基因后，细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA合成增加。胶原是细胞外基质的主要成份，在增生性瘢痕组织的细胞外基质中，Ⅰ型胶原纤维占主要构成，由2条α1链和1条α2链按比例构成。Zhang等[10]在研究中发现，增生性瘢痕组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA比正常组织表达增强，表达增强的部位主要存在于真皮浅层的纤维结节。通过我们的结果可以看出，转染NF1基因后，增生性瘢痕成纤维细胞比未转染的细胞表达瘢痕特征更加强烈，表明NF1表达增强可导致瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达加强，进而提示我们，控制NF1的过度表达有可能控制瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达，进而控制瘢痕组织中ECM过量沉积。

综上所述，我们已经证实瘢痕成纤维细胞可作为NF1转染的靶细胞。但是，通过抑制NF1基因来治疗瘢痕异常增生的临床应用，还有待进一步研究。

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Effects on Recombinant NF1 Gene on Collagen Expression of Hypertrophic Scar ifbroblasts In Vitro

ZHENG Jianghong,DENG Chenliang,DING Zhi,MAO Guangyu.YANG Songlin.
Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.Corresponding author:YANG Songlin.

ObjectiveTo explore the feasibility of transfecting recombinant NF1 into hypertrophic scar fibroblasts and investigate the proliferation and collagenⅠ,Ⅲsynthesis of transfected cells.MethodsRecombinant human NF1 gene was transfected into hypertrophic scar fibroblasts with the karyocyte expressive vector.The expression of NF1 gene,collagenⅠ,ⅢmRNA was quantified by real time PCR.The changes of cell proliferation were observed with CCK-8 colorimeter.Results Transfected hypertrophic scar fibroblasts showed positive green fluorescence nearly in 50%.The relative expression of NF1 mRNA in transfected cells,empty-vector cell and untransfected cells group are 7.27±1.16,2.01±0.38 and 1.87±0.29 respectively.Expression of NF1 mRNA increased significantly in transfected cells compared compared with either untransfected and empty-vector group(P＜0.01,n＝5).Expression of collagenⅠ,ⅢmRNA in transfected cells,empty-vector cell or untransfected cells group are 3.01±0.48,2.05±0.25;0.89±0.18,0.94±0.16;0.99±0.11,0.92±0.19 respectively, Expression of collagenⅠ,ⅢmRNA both increased significantly in transfected cells compared with either untransfected or empty-vector group(P＜0.01,n＝5).ConclusionThe hypertrophic scar fibroblasts seems to be the target cells of NF1 gene transfer.NF1 gene may be a critical factor,which caused abnormal collagen metabolism in hypertrophic scar.

Nuclear factor-1(NF1);Transfection;Hypertrphic scar;Fibroblast

Q753

A

1673－0364（2009）－01－0021－04

2008年11月19日；

2009年1月6日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.006

国家自然科学基金（30571929）；上海市卫生局资助课题（2006055）。

200233上海市上海交通大学医学院附属第六人民医院整形外科。

杨松林。