山药多酚氧化酶部分特性的研究

赵玉宏

摘 要：采用分光光度法测定波长410 nm处山药多酚氧化酶（PPO）的活性，研究了pH、温度、底物浓度、vmax和Km值以及抑制剂对山药PPO活性的影响。结果表明,山药PPO的最适pH=6.0,最适温度为35℃，底物浓度低于0.06 moL•L-1时，山药PPO活性与底物浓度呈线性关系，其Km=0.078moL•L-1,Vmax=0.259(△OD•min-1)，抑制剂柠檬酸、苹果酸、L-抗坏血酸对山药PPO活性均有抑制作用。

关键词：山药；多酚氧化酶；酶促褐变

中图分类号：S632.1 文献标识码：A 文章编号：1005-569X(2009)01-0047-04

山药(Rhizoma Dioscoreae)是一年生或多年生缠绕性藤本植物,在我国南方、西北、西南等地区种植普遍，资源丰富。山药中含有大量的蛋白质、各种维生素、有益的微量元素、粘质多糖等营养成分，还含有尿囊素、山药素、皂苷、胆碱、盐酸多巴胺等药用成分，是药食同源食品[1]。多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO，氧化还原酶，EC．1.10.3.1)是广泛存在于植物体、微生物（特别是霉菌）以及一些动物器官内由核基因编码、能催化多酚类氧化成醌类的含铜金属质体酶。PPO是引起山药加工、贮藏过程中褐变主要酶类，影响产品的感官质量[2-3]。本文对山药PPO的部分特性进行了研究，以对控制山药褐变地发生，延长其储藏期提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试山药采自恩施土家族苗族自治州利川市团堡乡。

1.2 试剂和仪器

L—抗坏血酸、苹果酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、邻苯二酚、甘氨酸、盐酸、醋酸、醋酸钠、丙酮，以上试剂均为分析纯。

高速冷冻离心机(日本KUBOTA公司，KUBOTA6930)、可见分光光度系统(上海尤尼柯仪器有限公司，UNIC2100)、数显水浴锅（金坛市富华仪器有限公司，HH-6）、电子分析天平（上海天平仪器厂，FA1004）。

1.3 实验方法

1.3.1 药液的配制

各种缓冲液的配制参照王秀奇等[4]的方法。

邻苯二酚需现配现用，用棕色试剂瓶保存。

1.3.2 山药PPO的提取

取无损伤的新鲜山药用预冷的蒸馏水冲洗干净后，用不锈钢刀迅速去皮，在流水条件下将去皮的山药切成小块，称取10 g山药，加入20 mL、浓度0.2 mol•L-1磷酸盐缓冲液(pH=6.0)，在冰浴中捣碎研磨成匀浆，冷冻离心(7000 r/min,10min,4℃)后弃渣，上清液中加入适量冷丙酮，缓慢搅拌15 min，离心分离取沉淀物。沉淀物冷风吹干后，加入25 mL，浓度为0.2 mol•L-1的磷酸盐缓冲液(pH=6.0)，制成酶液，保存在—4℃条件下备用。

1.3.3 山药PPO的活力测定

取磷酸盐缓冲液(pH=6.0)1.6 mL，加入1 mL浓度为0.04 mol•L-1的邻苯二酚溶液，35℃恒温5 min，加入0.1 mL山药PPO粗酶液混和均匀，在410 nm波长下迅速测定吸光度A410。每30秒测一次，测5分钟，每组重复三次。

一个酶活力单位定义为：吸光度值每分钟改变0.001为一个酶活力单位(U)。

1.3.4 pH对山药PPO活性的影响

用甘氨酸—盐酸(0.05 mol•L-1)缓冲液、NaAc—HAc(0.05 mol•L-1)缓冲液、Na2HPO4—NaH2 PO4 (0.2 mol•L-1)缓冲液调配反应体系的pH分别至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在35℃下水浴五分钟后测定山药PPO的活性。可以观察pH=2.0时，吸光度测完后比色皿中溶液的颜色无变化而pH为3.0、4.0、5.0时颜色变为浅褐色，pH至6.0、7.0、8.0时颜色更深，为褐色。

1.3.5 温度对山药PPO活性的影响

以0.04 mol•L-1的邻苯二酚水溶液1.0mL为底物,加入pH=6.0的磷酸缓冲1.9mL，在不同温度（20、25、30、35、40、50、60、70、80℃的温度条件下保温5分钟，加入相同温度下保温5分钟的PPO粗酶液0.1mL，混匀后迅速测定吸光度，转换为PPO的活性。

1.3.6 底物浓度对山药PPO活性的影响

分别以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol•L-1的邻苯二酚水溶液为底物，在pH=6.0、35℃条件下,测定不同底物浓度下山药PPO的活性。

1.3.7 山药PPO的Km和Vmax的测定

参照Lineweaver—Burk双倒数作图法[5]估算酶动力参数Km和Vmax。

1.3.8 抑制剂对山药PPO活性的影响

以0.04 mol•L-1邻苯二酚水溶液为底物,在pH=6.0、35℃条件下测定浓度分别为0.01 mol•L-1、0.05 mol•L-1、0.1 mol•L-1、0.15 mol•L-1的L—抗坏血酸、柠檬酸和苹果酸对山药PPO活性的抑制作用。

2 结果与分析

2.1 pH对山药PPO活性的影响

pH对山药PPO活性的影响如图1所示。

由图1山药PPO的活性与pH的关系曲线可以看出，pH值的变化对山药PPO的活性影响较大，山药PPO最适pH为6.0，这是因为其活性部位含有组氨酸基团(pK=6.0)所致，在pH为2.0-3.0时酶活性较低。因此在山药的加工处理中，可以调整pH至2.0以下，有利于减轻褐变。

2.2 温度对山药PPO活性的影响

酶活力随温度的变化曲线如图2所示。

从图2中可以看出，山药PPO的最适温度为35℃；温度低于35℃时,随着温度增加，反应速率加快；温度高于35℃时，随着温度增加，蛋白质分子的热运动增大，促进多重非共价键相互作用，导致蛋白分子破坏，使得山药PPO变性，反应速率逐渐降低；当温度超过45℃以上时鲜切山药PPO的活力呈明显下降趋势；当温度达到80℃时，山药PPO绝大部分失活；当温度接近90℃时PPO的活力已经完全钝化，此温度可作为工业生产中山药烫漂钝酶的参数。这同许多果蔬的PPO的最适温度在25-35℃之间的结果有所不同，如杏和香蕉中多酚氧化酶的活力分别在25℃和37℃时达到最高值[6-7]，马铃薯中多酚氧化酶以儿茶酚为底物时，它的活力在22℃时达到最高值[8]，这一差别的原因可能与山药的粘液多糖有关，其在高温下能形成胶状物质从而削弱热的作用。

2.3 底物浓度对山药PPO活性的影响

底物浓度与酶活力变化曲线如图3所示。

根据图3，当底物浓度小于0.06 mol•L-1，随着底物浓度的增加导致反应初速率有较大幅度的增加，多酚氧化酶活性与底物浓度呈线性关系；当底物浓度大于0.08 mol•L-1后，反应初速率开始趋于平缓。

2.4 山药PPO的Km和Vmax的测定

根据方程1/V=Km/Vmax{1/[S]}+1/Vmax，以1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，结果见图4。

由图4可以看出，以邻笨二酚为底物时，山药PPO的Km值为0.078mol•L-1，最大反应速度Vmax为0.259 (△OD•min-1)。

2.5 抑制剂对山药PPO活性的影响