缺血性脑损伤中ＨＳＰ７２对神经元保护作用的实验研究

张　芳　刘红芝　张兆成　宋远见

【摘要】 目的 探讨缺血性脑损伤中HSP72对大鼠神经元的保护作用及其分子机制。方法 将SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注对照组、热休克处理组、HSP72反义寡核苷酸组及溶剂组。采用焦油紫染色、免疫印迹检测大鼠缺血再灌注后海马神经元损伤和脑组织AKT、Bad(Ser 136)的磷酸化情况。结果 热休克处理组与缺血再灌注对照组、HSP72反义寡核苷酸组和溶剂组相比海马神经元损伤减轻，脑组织AKT和Bad(Ser 136)磷酸化升高(P<0．05)。结论 HSP72可能通过升高脑组织中AKT和Bad(Ser 136)的磷酸化程度起到海马神经元保护作用。

【关键词】缺血性脑损伤；HSP72；AKT；Bad(Ser 136)

Study on the neuroprotection of HSP72 during brain injury induced by ischemia

ZHANG Fang,LIU Hong-zhi,ZHANG Zhao-cheng,et al.

Basic Medical Science,Xuzhou Medical College,Xuzhou City,Jiangsu 221004,China

【Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of neuroprotection of HSP72 during Brain injury induced by ischemia.Methods SD rats were divided randomly into 5 groups:sham-operated;cerebral ischemia and reperfusion;cerebral ischemia and reperfusion+heat shock treatment;cerebral ischemia and reperfusion+antisense oligonucleotides and reperfusion+solvent.Brain injury in hippocampus of rats and change of phosphorylation of AKT and bad(ser 136)were detected by cresly violet-strained or immunoblot assay.Results Comparing with cerebral ischemia and reperfusion group, antisense oligonucleotides and solvent group,the brain injury and phosphorylation of AKT and bad(ser 136) of heat shock treatment team increased significantly.ConclusionHSP72 protected the neurons in hippocampus from ischemia by increasing phosphorylation of AKT and bad(ser 136).

【Key words】Ischemic brain injury; HSP72;AKT;Bad(Ser 128)

热休克蛋白（HSPs）因具有细胞抗氧化保护作用而成为研究的热点。高温能诱导热休克蛋白合成，HSP72是增强热耐受力的诱导型 HSPs的一种,但是它对缺血性脑损伤后神经元的保护机制尚不十分清楚。2008年1月至2008年9月，笔者通过观察HSP72对大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及AKT和Bad(Ser 136)磷酸化的影响，以探讨其对大鼠神经元的保护作用及机制。

1 材料与方法

1．1 动物及分组 雄性健康SD大鼠40只，体质量250～300 g，清洁级。将大鼠随机均分为两组，缺血15 min再灌5 d为甲组，再灌12 h为乙组。各组又分为假手术组、缺血再灌注对照组、热休克处理组、HSP72反义寡核苷酸组，各5只。

1．2 方法

1．2．1 动物模型制备 用20%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉动物后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉^[1-2]。手术第2天于动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15 min，然后不同的时间再灌注。缺血时保持其直肠温度在36．5℃～37．5℃。以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组的处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。热休克处理组于缺血前2 h置于42℃温箱中热休克预处理40 min，HSP72反义寡核苷酸组在热休克预处理的同时腹腔注射HSP72反义寡核苷酸0．5 ml（5-TGTTTTCTTGGCCAT-3,浓度200 μmol/L）^[3]。

1．2．2样品制备和免疫印迹 甲组于再灌注第5天，以水合氯醛麻醉大鼠，然后以生理盐水和4%多聚甲醛进行心室灌注^[1]。取脑组织在4℃多聚甲醛中固定1 d以上后，于梯度乙醇溶液中脱水并在二甲苯中透明。包蜡后的脑组织进行切片(5 μm)，经脱蜡、二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。取海马CA1区1 mm 内的细胞数量作为计数标准。乙组于再灌注12 h将大鼠快速断头取脑，分离双侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行。从液氮中取出海马，加1．7 ml匀浆缓冲液，用Teflon匀浆器高速匀浆（10 s×6次），800 g×10 min离心，弃上清液，加入0．6 ml buffer B振荡摇匀，12 000 g×10 min离心，取上清，按改良Lowry法，以牛血清白蛋白为标准蛋白测蛋白后分装，置-80℃冰箱待用。按Sambrook等方法，等量蛋白样品经7．5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以湿转法电转移至NC膜上。转移后的NC膜经3% BSA室温封闭3 h后加入一抗AKT和Bad(Ser 136)，4℃过夜。用洗涤液洗膜3遍，加入二抗羊抗兔IgG-AP（Sigma公司），37℃反应2 h，洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。结果用图像处理仪（Gene Company）分析处理。

1．2．3 统计学方法 采用SPSS 10．0统计软件，计量资料以均值±标准差(x±s)表示，统计分析采用方差分析(ANOVA)。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

HSP72能减少海马神经元损伤及脑组织AKT和Bad(Ser 136)的磷酸化程度。见表1。

3 讨论

研究证实:与假手术组比较，缺血再灌注组第5天海马神经元损伤严重；再灌注12 h脑组织中AKT和Bad(Ser 136)的磷酸化程度显著增高(P<0．05)^[1-2]。故本实验仅取甲组的存活神经元数、存活量表示大鼠海马CA1区神经元细胞存活情况，用乙组的AKT和Bad(Ser 136)数值表示大鼠AKT和Bad(ser 136)的磷酸化情况。

HSP是生物体细胞在一系列应激因素作用下产生,是具有高度保守性的细胞保护性蛋白质,其中HSP70家族与细胞保护之间的关系最密切,它在机体细胞耐受、机体免疫调节、遗传物质保护、基因调控、细胞增殖分化、肿瘤发生发展等过程中起重要作用。HSP70家族主要有诱导型的HSP72和结构型的HSP73两个亚型,在应激过程中主要为HSP72表达变化^[4-5]。脑海马CA1区是对缺血最为敏感而发生大量细胞凋亡的区域之一^[2],本实验通过焦油紫染色法检测海马CA1区神经元的凋亡情况证实了这一点。在本实验结果显示：热休克处理组海马CA1区神经元凋亡明显少于缺血再灌注对照组、HSP72反义寡核苷酸组，说明HSP72对脑缺血再灌注引起的海马CA1区神经元凋亡具有很好的保护作用。

激活后的Akt能使底物中的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化而起到抗凋亡和保护细胞的作用。目前认为，磷酸化后的Akt可通过作用于Bad、Caspase 9等底物或下游因子抑制细胞凋亡^[6-8]。近年来研究表明, Akt活化后能经多种途径促进细胞存活,其重要机制之一就是通过磷酸化 Bcl-2家族成员Bad实现其促进生长的作用。Bad是否磷酸化关系到细胞的成活和死亡,是神经存活因子控制神经细胞凋亡的重要环节。Bad的功能受它的Ser-112和Ser-136位点磷酸化所调节。磷酸化的Bad能与伴侣蛋白(Chaperone)14-3-3蛋白相互作用,Bad-14-3-3结合物可释放Bcl-2和/或 Bcl-xl,发挥抗细胞凋亡效应。Akt是强有力的Bad（Ser-136）激酶,活化的 Akt可以使Bad的Ser-136位点磷酸化,有效阻断 Bad诱导的细胞死亡^[9,10]。本实验研究发现，脑缺血再灌注后15 min时脑组织中Akt和Bad(Ser 136)的磷酸化程度相对假手术组明显降低，30 min时开始升高，3 h时达到最高，而后逐渐降低，到12 h时回到与假手术组相近的水平，实验证实这一回落导致了细胞严重损伤^[2]。为进一步探索HSP72对缺血性脑损伤的保护作用是否与Akt信号通路有关，在实验中笔者使用免疫印迹方法检测各组大鼠脑海马组织中Akt和Bad(Ser136)磷酸化水平。发现热休克处理组的磷酸化水平明显高于其他组，因而推测Akt信号通路可能介导HSP72对神经元的保护作用。

本实验结果证明:HSP72可以明显上调Akt和Bad(Ser136)的磷酸化水平,减少神经元凋亡,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。关于HSP72的脑保护作用的其他可能机制笔者将做进一步的研究。

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