生防枯草芽孢杆菌Ｌ１特性的初步研究

李永刚　宋兴舜　赵雪莹　马凤鸣

摘要：通过对峙培养，测定出枯草芽孢杆菌L1的抑菌谱较宽，特别是对水稻纹枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷镰孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果明显；枯草芽孢杆菌L1不同发酵时间经湿热灭菌处理后，5 d发酵液中抑菌活性物质含量最高，对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制率达83.23％，发酵液随时间延长抑菌效果不再增加；枯草芽孢杆菌L1新疆棉花立枯病根际拮抗放线菌的筛选1抑菌活性物质对温度不敏感；枯草芽孢杆菌L1发酵液用硫酸铵梯度沉淀法提取粗蛋白在硫酸铵饱和度达60％～70％(不含60％)沉淀的活性物质抑菌效果最好，对水稻纹枯病菌平均抑菌半径达1.15；枯草芽孢杆菌L1对玉米、大豆、小麦、番茄、菜豆、黄瓜、水稻无致病性，而且还有保鲜和促生作用。

关键词：枯草芽孢杆菌；抑菌物质；粗蛋白；致病性

中图分类号：S 482．292

水稻纹枯病(rice sheath blight)是水稻上三大重要病害之一，从全国范围看，部分省、地区稻纹枯病超过稻瘟病的危害，居水稻三大病害之首。由于当前推广的水稻品种缺乏高抗纹枯病基因，随着矮秆品种和杂交水稻的大面积推广及水田管理等措施的影响，水稻纹枯病发生面积正逐年扩大，导致我国水稻产量年损失在10％以上。长期以来，我国大多数稻区都使用井冈霉素防治，虽然井冈霉素能够有效地控制水稻纹枯病，但是大面积、长期使用井冈霉素，极易导致病原菌Rhizoctonia solani产生抗药性，这个问题已引起国内外有关专家的高度关注。戊菌隆等防治纹枯病的化学农药又产生毒性及残留问题，且污染环境。所以，探索新的防治途径十分必要。

在研究开发的各种生防菌中，利用生防细菌来防治植物病害成为国内外在生物防治研究中的一个热点。大量的研究表明，生防细菌不仅在其生长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，通过直接或间接作用，达到阻碍或杀死病原菌的效果，而且这些细菌多是从植物的根围和叶围等处分离得到的，对植物具有较好的亲和性，接种后易于在植物上定殖，生防效果持久稳定。

芽孢杆菌(Bacillus spp.)是一类受到广泛重视的拮抗细菌，其显著特点是芽孢对干燥、热、紫外线及有机溶剂的抗性。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)生防菌株获得环保局(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可，它们是GB03、MBI600、QST713和B.subtilis var.amyloliqudefa-ciens FZB24；在国内，1998年陈志谊应用Bacillussubtilis B916防治水稻纹枯病面积达2 000 hm²，防治效果达50.0％～81.9％，说明用Bacillus来开发生防制剂的巨大优势。

本课题组从水稻根际中筛选到1株对水稻纹枯病菌具有很好拮抗效果的枯草芽孢杆菌L1，围绕该菌的特性，进行了相关研究。

1材料与方法

1．1枯草芽孢杆菌L1抑菌谱的测定

1．1．1供试生防菌株

枯草芽孢杆菌L1由本课题组自水稻根际土中分离、鉴定并保存。

1．1．2供试病原菌

供试菌株为桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、水稻纹枯病菌[Rhizoctonia solani(rice)]、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、大豆菌核病菌(Sclerotinia scle-rotiorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、辣椒灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)，由本实验室自行分离并保存，其中水稻纹枯病菌为指示菌株。

1．1．3培养基

固体培养细菌采用NA(牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20 g、水1 000 mL、pH7.0)，液体培养采用KB(蛋白胨20.0 g、K₂HPO₄·3H₂O2.5 g、MgSO₄·7H₂O15.0 g、甘油10 mL、水1 000 mL、pH7.0)，拮抗作用测定用PDA(马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL)。

1．1．4试验方法

对供试的9种植物病原菌进行拮抗作用的测定，枯草芽孢杆菌L1在NA培养基上28℃活化48 h后画线接种在距PDA平板中心3 cm处，然后在此PDA平板的中央接种经过扩繁的水稻纹枯病菌菌碟(d=0.7 cm)，每个处理3次重复，放入恒温箱中26℃培养96 h后测量植物病原菌菌丝生长的最长半径与最短半径，计算其比值。

1．2不同时间处理发酵液对水稻纹枯病菌菌丝生长的影响

生防细菌在定量100 mL KB液体培养基中28℃170 r／min振荡培养1、2、3、4、5、6、7、10 d后，湿热灭菌后取滤液加入定量的PDA培养基中使用浓度达到2％，充分混匀，倒入15 mL于灭菌的培养皿中，待培养基冷却后在平板中央接种0.7 cm的水稻纹枯病菌菌碟，以无菌水处理为空白对照，每个处理3次重复，26℃培养48 h后测定水稻纹枯病菌菌落直径，计算抑菌率。

1．3不同温度处理发酵液对水稻纹枯病菌菌丝生长的影响

将枯草芽孢杆菌L1在定量100mL KB液体培养基中(装液量100 mL／300 mL三角瓶)28℃170 r／min振荡培养，培养48 h的菌液经细菌滤器过滤后，经过20℃、-20℃处理24 h，121℃处理20 min后，采用菌丝生长速率法按3％的浓度测定其抑菌率，方法同1.2，加无菌水处理为空白对照，每个处理3次重复，26℃培养48 h后测定水稻纹枯病菌菌落直径，计算抑菌率。

1．4抗菌粗蛋白质的提取及活性测定

1．4．1抗菌粗蛋白质的提取

参照邵敏蛋白提取方法略有改进，将枯草芽孢杆菌L1接种于KB液体培养基中，振荡培养过夜作为种子液，按1％接种量转接于KB液体培养基中(装液量100 mL／300 mL三角瓶)，28℃170 r／min培养48 h；发酵液经滤纸过滤后，再通过细菌滤器除去菌体，收集滤液；抗菌粗蛋白质采用(NH₄)₂SO₄分级沉淀法提取，7个硫酸铵梯度分别为：0～30％(含30％)、30％～40％(不含30％)、40％～50％(不含40％)、50％～60％(不含50％)、60％～70％(不含60％)、70％～80％(不含70％)、80％～100％(不

含80％)沉淀蛋白；4℃8 000 r／min离心20 min收集沉淀，溶于适量10 mmol／L的磷酸钠盐缓冲液(PBS，pH8.0)中；将蛋白溶液装入处理好的透析袋(截留分子量12 000 D)中，4℃下用同缓冲液透析脱盐。离心弃不溶性沉淀，上清液即为抗菌粗蛋白，用于抑菌活性检测。

1．4．2抗菌粗蛋白质对水稻纹枯病菌抑菌作用的测定

准备好PDA平板，在距离PDA平板中央3 cm处用内径为0.7 cm的打孔器在对称的方向上打2个孔，取0. 03 mL上述分级提取的抑菌粗蛋白注入每个孔中，然后在此PDA平板中央接种直径为0.7cm水稻纹枯病菌菌碟，以无菌水为对照，每个处理3个重复，26℃培养72 h后测量抑菌的半径，分析比较差异显著性。

1．5枯草芽孢杆菌L1对部分植物种子和果实致病性的测定

将枯草芽孢杆菌L1接种到KB液体培养基中，培养48 h后稀释1倍备用。

玉米、小麦、水稻、大豆种子100粒采用枯草芽孢杆菌L1培养液浸泡1 h，取出晾干后催芽；而番茄和菜豆采用整个果实，黄瓜切成厚度为2 cm的圆片测定，浸泡1 h，取出晾干，然后放入封口袋中保湿，无菌水处理为对照，26℃保存4 d，观察形态变化。

2结果与分析

2．1枯草芽孢杆菌L1抑菌谱的测定

采用菌丝生长速率法，测定枯草芽孢杆菌L1对9种植物病原真菌菌丝生长的影响，结果见表1。

从表1可以看出，枯草芽孢杆菌L1对这9种植物病原菌都有一定的拮抗作用，其中对水稻纹枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷镰孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果较好，拮抗最长半径(cm)与最短半径(cm)3次平均值分别为2.17、2.90、2.27、2.03、2.20。

2．2不同培养时间发酵液对水稻纹枯病菌菌丝生长的影响

对枯草芽孢杆菌L1进行液体发酵培养，测定该菌株分泌抗菌次生代谢产物达到平衡的时间，对培养菌株L1不同时间取样，进行湿热灭菌，采用菌丝生长速率法测定其对水稻纹枯病菌抑菌效果，加无菌水作为对照，结果见表2。

从表2可以看出，枯草芽孢杆菌L1不同培养时间的发酵液经灭菌处理后，对水稻纹枯病菌菌丝抑制率存在差异，培养5 d与6、7、10 d的发酵液抑制率差异不显著，而与4 d之前的发酵液存在显著差异，说明培养5 d时发酵液中抑菌活性物质含量达最高，达83.23％，随时间延长抑菌效果不再增加。

2．3不同温度处理发酵液对水稻纹枯病菌菌丝的影响

测定枯草芽孢杆菌L1起抑菌作用的活性物质受温度影响，将培养好的发酵液经细菌滤器过滤后，20℃、-20℃处理24 h，121℃处理20 min后，无菌水为对照，测定抑菌直径，结果见表3。

从表3中可以看出，枯草芽孢杆菌L1的发酵液经20℃、-20℃和121℃分别处理后，菌株L1发酵液的抑菌效果在0.01水平上差异不显著，说明枯草芽孢杆菌L1起抑菌作用的活性物质受温度影响较小，对温度不敏感。

2．4抗菌粗蛋白对水稻纹枯病菌菌丝生长的影响

抗菌粗蛋白质采用(NH₄)₂SO₄分级沉淀法提取后，测定其对水稻纹枯病菌的抑菌作用，结果见表4。

从表4可以看出，硫酸铵粗蛋白分离纯化后的7个梯度的粗蛋白对水稻纹枯病菌菌丝均具有一定的抑制作用，其中硫酸铵饱和度达60％～70％(不含60％)和其他梯度的存在显著差异，其抑制效果最好，平均抑菌半径达1.15 cm，说明枯草芽孢杆菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸铵饱和度达60％～70％(不含60％)沉淀的活性物质中，其活性物质有待于进一步深入研究。

2．5枯草芽孢杆菌L1对部分植物种子和果实致病性的测定

为测定枯草芽孢杆菌L1对田间其他作物是否有致病能力。观察其致病性。用枯草芽孢杆菌L1的发酵液对玉米、大豆、小麦、水稻种子及番茄、菜豆、黄瓜果实进行浸泡处理，果实96 h、种子待发芽后观察表观特征，结果见表5。

从表5结果可以看出，枯草芽孢杆菌L1对玉米、大豆、小麦、番茄、菜豆、黄瓜、水稻均无致病作用，而且对小麦、水稻种子发芽和生长有促进作用，对黄瓜和番茄有一定的保鲜作用，其机制有待于进一步深入研究。

3结论

枯草芽孢杆菌L1的抑菌谱比较广，尤其对水稻纹枯病菌、大豆菌核病菌、禾谷镰孢菌、辣椒灰霉病菌、玉米小斑病菌抑菌效果较好。

枯草芽孢杆菌L1不同培养时间的发酵液经湿热灭菌处理后，对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制率存在差异，培养5 d发酵液与6、7、10 d的差异不显著，而与4 d以前的差异显著，说明培养5 d时培养液中抑菌物质含量达到平衡，抑菌效果最好，抑菌率为83.23％。

枯草芽孢杆菌L1的发酵液经20℃、-20℃和121℃分别处理后，其对水稻纹枯病菌菌丝生长的抑制率在0.01水平上差异不显著，说明枯草芽孢杆菌L1起抑菌作用的活性物质受温度影响不大，对温度不敏感。

采用硫酸铵梯度沉淀法沉淀枯草芽孢杆菌L1分泌的蛋白，7个梯度沉淀的蛋白对水稻纹枯病菌生长的影响不同，其中硫酸铵饱和度达60％～70％(不含60％)沉淀的活性物质抑菌效果最好，平均抑菌半径达1.15 cm，说明枯草芽孢杆菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸铵饱和度达60％～70％(不含60％)沉淀的蛋白。

枯草芽孢杆菌L1对玉米、大豆、小麦、番茄、菜豆、黄瓜、水稻无致病性。

4讨论

枯草芽孢杆菌L1的抑菌谱广泛，且对多种田间作物重要病原菌有较好抑制效果，为芽孢杆菌L1的进一步应用研究奠定了良好的基础。

枯草芽孢杆菌L1培养5 d时培养液中抑菌物质含量达到平衡，抑菌效果最好，随时间延长其分泌的抑菌活性物质不再增加，抑菌活性物质对温度不敏感，该特性对菌株L1的开发和应用奠定了良好的基础。

从上述表2和表3可以看出，枯草芽孢杆菌L1发酵液直接灭菌和用细菌滤器过滤菌体后进行灭菌，前者抑菌效果明显高于后者，说明枯草芽孢杆菌L1产生的抑菌物质可能还有胞内物质，下一步进行深入研究。

枯草芽孢杆菌L1分泌的抑菌蛋白主要集中在硫酸铵饱和度达60％～70％(不含60％)沉淀的活性物质，在其他饱和度下也有抑菌物质存在，说明枯草芽孢杆菌L1产生并非一种抑菌活性物质，抑菌活性物质的种类和数量有待于进一步研究。

枯草芽孢杆菌L1对多种作物无致病能力为该菌株今后能在田间进行下一步试验提供保证；另外，枯草芽孢杆菌L1对黄瓜和番茄有一定的保鲜作用，且对灰霉病菌也有较好的拮抗作用，因此可以向蔬菜保鲜剂方面进行扩展。