一种高效分离荔枝霜疫霉病菌的新方法

岑贞陆　黄思良

摘要作者将常规植物病原菌组织分离法改进成一种适合于荔枝霜疫霉病菌分离的简便、高效的新方法。分离的荔枝果实经过100μg／mL多菌灵及36μg／mL链霉素的混合药液浸泡处理，在无菌保湿的条件下采用病果对健果进行病害诱发后进行病原菌的分离纯化。该新方法分离荔枝霜疫霉病菌的成功几率大于传统组织分离法。

关键词荔枝；霜疫霉病菌；分离

中图分类号S 436.67

荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)是荔枝的主要病害之一，其分类学地位是一科一属一种，较为特殊。为了对荔枝霜疫霉病菌进行相关研究，通过分离而获得纯的荔枝霜疫霉病菌是必要的。常规的病原菌分离方法是《植病研究方法》介绍的用75％乙醇和0.1％升汞液表面消毒处理。实际工作中，在实验室进行分离的样本往往不是新鲜样品，特别是存放时间过长的荔枝病果组织中常常带有其他杂菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些杂菌的生长较荔枝霜疫霉病菌迅速，杂菌的菌丝常将荔枝霜疫霉病菌覆盖，而细菌也会抑制荔枝霜疫霉病菌的生长。另外，荔枝霜疫霉病菌在常规培养基如PDA上生长较差，而特殊培养基的配制又相对麻烦。因此，采用常规分离真菌方法分离荔枝霜疫霉病菌分离纯化效果差，往往不易成功。为此，作者试将常规的真菌分离方法改进成一种更为简便快捷分离荔枝霜疫霉病菌的新方法。

1分离操作

先将加热熔化了的纯琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基凝固后用打孔器(直径为3～4mm)将培养基打成圆碟备用。再准备两个无菌的容器，容器内装有用无菌水配成的含有100μg／mL多菌灵及36μg／mL链霉素的混合药液。将新采集的荔枝病果(品种为黑叶)置于RH为90％的密闭干燥器3～5d后，再采集新鲜健康果实(品种为黑叶)，然后将病果、健果分别浸泡于上述混合药液中10min后捞起，分开晾干，在无菌塑料盒中放置4～8个健果(紧靠在一起排成一字形)，在队列一端紧靠健果再放置1个病果，室温下使健果发病，当健果发病后，将原先的病果移走，依此类推，移走3～5个病果后，用接种针挑取纯琼脂圆碟，将纯琼脂圆碟轻触塑料盒中病组织上的病菌孢子囊梗(注意：纯琼脂圆碟不要点触到荔枝果皮)，使病菌分生孢子囊粘在纯琼脂圆碟上，然后将纯琼脂圆碟置于玉米粉琼胶培养基(玉米粉300g、琼脂17g、水1000mL)平板中央，于25℃恒温箱中培养，待病菌形成菌落，镜检观察其培养性状及有无其他杂菌，确认是荔枝霜疫霉病菌并进行单孢子纯化，经柯氏法则确认其致病性后，将病原菌保存备用。

2分离结果

在采用新方法进行分离的试验中，共挑刺107个纯琼脂圆碟，5d后观察到有83个纯琼脂圆碟在玉米粉琼胶培养基平板上长出荔枝霜疫霉病菌菌落，其中有34个荔枝霜疫霉病菌菌落受到其他杂菌的污染，结果显示，分离出纯荔枝霜疫霉病菌培养物的频率为45.79％；而采用传统组织分离方法进行分离的试验中，共对96个组织块进行分离，5d后观察到长出真菌或细菌菌落的组织块共68个，对分离所得的真菌菌落进行镜检，没有观察到荔枝霜疫霉病菌。

3小结

与常规组织分离方法相比，该新方法具有以下优点：(1)简便、快捷、实用，不需要配制特殊的培养基，并省去乙醇和升汞消毒处理。(2)荔枝果实先经过药液浸泡处理，绝大部分杂菌已被杀死或被抑制，分离成功几率大。