血管紧张素Ⅱ受体阻断剂对大鼠机械通气所致肺损伤的保护作用

冯　丹　姚尚龙　尚　游　武庆平　王立奎

【摘要】目的研究血管紧张素Ⅱ受体阻断剂洛沙坦对大鼠机械通气所致肺损伤(VILI)的保护作用及其机制。方法40只健康SD大鼠随机均分成A、B、c、D四组：A组为对照组；B组为正常潮气量机械通气组，潮气量(V_T)为10 ml／kg；c组为大潮气量机械通气通气组，V_T为40ml／kg；D组为大潮气量通气加洛沙坦处理组，_T为4 0ml／kg，D组大鼠实验前30 min用血管紧张素Ⅱ受体(ATl型)特异性阻断剂洛沙坦(Losartan)溶液30 m∥kg腹腔注射。B、c、D三组机械通气频率(P)均为80次／min，通气时间均为2 h。实验完毕收集肺组织和肺泡灌洗液标本。光镜观察肺病理改变，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测A、B、C三组肺组织中血管紧张素原的表达水平，TUNEL法检测肺组织细胞凋亡情况，同时测定肺灌洗液总蛋白、白细胞计数、肺湿／干比以及肺组织髓过氧化物酶(MPO)的水平。结果B组和A组各项指标差异无统计学意义；与A、B组相比，c组肺病理改变明显，肺细胞凋亡显著性增多，血管紧张素原的表达水平显著增高(P＜0.01)，肺湿／干比、总蛋白、白细胞计数、MPO等指标均显著性增高(P＜0.01)；与C组比较，D组肺病理改变明显减轻，肺细胞凋亡、肺湿／干比、总蛋白、白细胞计数、MPO等指标均显著性降低(P＜0.05或P＜0.01)。结论血管紧张素Ⅱ可能在VILI的致病机理中起着一定的作用，特异性阻断血管紧张素Ⅱ受体(ATl型)能显著减轻VILI时肺损伤和炎症反应的程度。

【关键词】机械通气所致肺损伤；机械通气；洛沙坦

在人和大鼠的肺组织中存在着局部的肾素-血管紧张素系统(RAS)，其中以血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)及其受体较为重要，在调节肺细胞的生长、凋亡等方面起着重要作用。ANGⅡ可能在各种急性肺损伤中起着重要的作用。研究证明，在多种原因所致的急性肺损伤中，肺组织中ANGⅡ的表达水平均显著增高，而阻断ANGⅡ受体或减少ANGⅡ的生成可以减轻多种原因所致的急性肺损伤，减轻肺水肿程度，抑制中性粒细胞的浸润和肺细胞的凋亡。机械通气所致的肺损伤(ventilator-induced lung injury，VILI)是肺功能严重受损的患者行机械通气支持治疗时的常见并发症，其主要致病机制之一可能是由于过度的机械刺激(如牵拉、切变力、剪切力等)激活了肺细胞多种致炎因子的表达，引起白细胞(特别是中性粒细胞)在肺组织中的“募集”，导致肺组织的急性炎性损伤。目前，ANGⅡ及其受体在VIU中的作用在国内外还很少有人研究。本试验拟通过建立大鼠VILI实验模型，以血管紧张素原(ANGⅡ的前体)的表达水平间接反映ANGⅡ的水平，以ANGⅡ受体(ATl型)特异性阻断剂洛沙坦預处理VILI的大鼠，来研究ANGⅡ(ATl型)受体阻断剂洛沙坦对大鼠机械通气所致肺损伤(VILI)的保护作用及其机制。

1材料与方法

1．1主要试剂

Tfizol提取液、逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自深圳晶美生物工程有限公司，PCR特异性引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司，总蛋白和MPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，FUNEL分析试剂盒为武汉博士德公司提供，AT₁受鞴异性的阻断剂洛沙坦(Losartan)购自美国Cayman公司。

1．2动物与分组

40只健康SD大鼠，体质量300～350 g，随机应分成A、B、C、D四组：A组空白对照组，不行机械通气；B组为正常潮气量通气组，潮气量(V_T)为10 ml／kg，呼吸频率(P)为80次／min；C丑为大潮气量机械通气通气组，V_T为40 ml／kg，P为80次／min；D组为大潮气量机械通气通气加Losartan处理组，V_T为40 ml／kg，呼吸频率(P)80次／min，D组大鼠在实验前30 min用Losartan溶液30 mg／kg腹腔注射(Losartan粉剂溶于PBS中)。

1．3动物模型

20％乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，起效后行气管切开，A组大鼠直接处死，其他各组大鼠则插入气管导管(用胶管自制)行机械通气(浙江大学医学仪器厂提供)，机械通气参数统一设置成VT为40 ml／kg或10 ml／kg，呼吸频率(RR)80次／min，吸／呼比(I：E)为1：2，PEEP为零，吸入气体为室内空气。皮下切开行股静脉穿刺置管，静脉给阿曲库铵维持肌松。颈内动脉穿刺置管，监测动脉血压、心率、血气等。本研究C、D两组大鼠大潮气量机械通气的潮气量设为40 ml／kg，这是参考Karzai等的实验研究并稍作修改。

机械通气达到预定时间后，放血处死大鼠。小心分离左右两侧完整肺组织，部分右侧肺组织用多聚甲醛溶液固定，用于病理切片以及细胞凋亡检测。左肺用生理盐水行肺灌洗(2 ml×3次)，回收的肺灌洗液应大于90％。回收后立即离心10 min(2500 r／min)，沉淀物用PBS缓冲液稀释后光镜下行白细胞计数，上清液置于-70℃冰箱保存待检。

1．4检测指标

对于肺组织标本，具体检测各组肺组织病理改变，血管紧张素原基因的表达，TUNEL法检测肺细胞的凋亡，同时检测肺湿干重比值以及肺组织中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)的水平；对于肺灌洗液标本，具体检测肺灌洗液中总蛋白浓度以及白细胞计数的水平。具体方法如下：

(1)肺湿干重(W／D)比值测定取动物一叶右肺组织，称湿重后置于烤箱中，70℃烘烤至恒重后称干重，计算肺W／D比值。

(2)TUNEL法检测凋亡细胞用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法(TUNEL法)分析肺组织中细胞凋亡的情况，通过原位测定肺组织切片中的DNA片段对损伤的肺组织中细胞凋亡的程度进行评价。细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞，在400倍光镜下每张切片随机观察10个视野，计算每个高倍视野中阳性细胞数和该高倍视野中细胞总数的比值，以百分数表示，即凋亡指数(apoptosis index，AI)。

(3)总蛋白和MPO肺灌洗液中总蛋白的测定采用考马斯亮蓝染色法，采用UV-2000型分光光度计测量吸光度；肺组织中MPO活性测定采用专用MPO试剂盒，先准确称取肺组织重量，按重量体积比用匀浆缓冲液(试剂盒中自备)进行匀浆，其后所有步骤均严格按照试剂盒进行，最后测量特定波长下吸光度。MPO活性单位定义为：每克肺组织湿片在37℃反应体系中H₂O₂被分解1 μmol为

一个酶活力单位。

(4)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)肺组织中血管紧张素原(ANG)等基因表达水平的检测采用RT-PCR的方法，具体方法如下：①RNA的提取准确称取100 mg肺组织，匀浆后依次加入适当体积的Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇进行RNA抽提，确定样品RNA的质量和纯度。②RNA逆转录抽取1 μg总RNA，严格按逆转录试剂盒所提供的方法合成cDNA。③PCR PCR反应体系包括：cDNA 4 μl，Buffer 5 μl，dNTP l μl，引物的正义链和反义链各1 μl，MgCl₂₅ 4 μl，Taq酶1 μl，加水至50 μl。内参采用管家基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。PCR反应设定如下，先95℃预变性4～5 min，扩增30～35个循环，每个循环包括如下步骤：①变性94℃时30 s；②退火：55℃时30 s(GAPDH)，60℃时30 s(ANG)；③延伸72℃时45s，最后72℃延伸7～10 min，4℃终止反应。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统采集图像，用图像分析软件(]magemaster)分析目的基因片段OD值。ANG特异引物为，正义链：5CCTCGCTCTCTGGACTFATC 3，反义链：5CAGACACTGAGGTGC TGT TG 3，目的基因片段长度为226 bp；GAPDH特异性的引物为，正义链：5TGAAGGTCGGTGTCAACGGATITGGC 3，反义链：5CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC 3，目的基因片段长度为983 bp。

1．5统计学方法

测定值用均数±标准差(χ±s)，用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析，组问两两比较采用LSD-τ检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1病理学改变

A组为正常肺组织病理图片；B组肺组织病理基本正常，肺泡间隔正常，偶见少量的炎性细胞以及巨噬细胞，肺泡腔无渗出物；C组肺组织出现明显的炎性损伤性改变，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内可见较多的炎性细胞浸润，部分肺泡腔内有渗出液；和C组比较，D组肺组织病理改变明显减轻，肺泡间隔一定程度增厚，但轻于C组，肺泡腔可见少量炎性细胞浸润，部分肺泡腔有少量渗出物。

2．2RT－PCR检测血管紧张素原(ANG)基因的表达

ANG表达水平以ANG／GAPDH光密度比值表示。与A组(0.17±0.04)比较，B组ANG基因的表达水平(0.19±0.06)差异无统计学意义(P＞0.05)；与B组比较，C组ANG基因的表达水平(0.65±0.16)显著增高(P＜0.01)。

2．3TUNEL检测肺细胞的凋亡

A组肺组织有少量肺细胞凋亡；与A组相比，B组肺组织细胞凋亡数目差异无统计学意义(P＞0.05)；与A、B组相比，C组细胞凋亡数目显著性增加(P＜0.01)；与C组相比，D组肺细胞凋亡数目显著性降低(P＜0.01)。

与A、B组相比，C组肺灌洗液(肺组织)中总蛋白、总细胞计数、MPO、肺湿干重(W／D)比值、凋亡指数(AI)等指标显著性增高(P＜0.01)；与c组比较，D组上述各项指标均显著性降低(P＜0.05)；A、B两组上述各项指标差异无统计学意义。

3讨论

机械通气所致的肺损伤(VILI)致病机制非常复杂，包括机械伤和生物伤等。前者是指高气道压力或高容积等机械刺激造成肺泡、肺毛细血管壁破裂及肺弥漫性水肿等损伤；而生物伤是指肺部急性炎性损伤，是目前研究的热点，指过度的机械刺激(如牵拉、切变力等)激活了肺细胞内多种与炎症密切相关的信号转导通路，如p38MAPK、JNKs以及NF-kB系统等多种信号转导通路的激活，使各种致炎因子的表达显著增多，引起白细胞(特别是中性粒细胞)在肺组织“募集”，从而造成肺的急性炎性损伤。血管紧张素Ⅱ是一种具有血管收缩作用的多肽，其受体主要分为两型，即ATl和AT2型，血管紧张素Ⅱ主要通过ATl受体发挥作用。血管紧张素Ⅱ不仅调节血管的收缩，还在血管的炎症反应中发挥着重要的调节作用。研究证明，血管紧张素Ⅱ通过激活ATl受体，可激活血管内皮细胞和平滑肌细胞上多种和炎症相关的信号转导通路，如p38MAPK、JNKs以及NF-kB系统等。血管紧张素Ⅱ通过激活ATl受体，可上调血管内皮细胞和平滑肌细胞内多种炎性细胞因子、黏附分子以及趋化因子的表达。血管紧张素Ⅱ及其受体不仅广泛存在于心血管系统，还分布于肺组织细胞。研究表明，除了在血管炎性反应中起着重要的作用外，血管紧张素Ⅱ及其受体可能还在各种急性肺损伤中起着重要的作用。动物研究表明，在多种原因所致的急性肺损伤中，肺组织中血管紧张素Ⅱ的表达水平均显著增高，而阻断血管紧张素Ⅱ受体或减少血管紧张素Ⅱ的生成可以减轻多种原因所致的急性肺损伤，抑制中性粒细胞的浸润，减轻肺水肿程度。目前，有关血管紧张素Ⅱ及其受体在VILI中的作用还很少有人研究。因此，在本研究中笔者建立了大鼠VILI实验模型，以血管紧张素原的表达(血管紧张素Ⅱ的前体)来问接反映血管紧张素Ⅱ的水平，用血管紧张素Ⅱ受体(ATl型)阻断剂洛沙坦(Losartan)预处理VILI的大鼠，研究血管紧张素Ⅱ在VILI中的作用。

在本实验中，与A、B两组大鼠各项指标差异无统计学意义，说明与A组相比，正常潮气量机械通气并没有产生急性肺损伤。与A组、B组相比，C组大鼠肺病理改变明显，可见肺间隔增厚，肺泡腔较多的白细胞浸润，部分肺泡间隔断裂，偶有肺大泡形成；C组细胞凋亡数量、肺湿／干比、总蛋白、白细胞计数、MPO等指标均显著性增高。MPO是中性粒细胞释放的一种过氧化物酶类，和中性粒细胞的数目存在极显著的相关性，可反映肺组织中性粒细胞浸入的水平。这说明C组大潮气量机械通气产生了明显的肺損伤，即VILI，表现为肺水肿、白细胞(特别是中性粒细胞)的浸润以及肺上皮细胞的凋亡等。另外，在本实验中，A、B组相比，C组大鼠肺组织中血管紧张素原的基因表达水平显著性增高，表明大潮气量机械通气明显上调了肺细胞血管紧张素原的表达，间接说明VILI时血管紧张素Ⅱ的表达显著增高。在本研究中，D组行大潮气量机械通气之前用ATl受体阻断剂Losartan预处理。结果发现，与C组相比，D组细胞凋亡数量、肺湿／干比、总蛋白、白细胞计数、MPO等指标均显著性降低。表明Losartan显著减轻了VILI时急性肺损伤的程度和炎症反应的水平。

作为ATl受体特异性阻断剂，Losartan对大鼠VILI的保护作用可能和阻断血管紧张素Ⅱ的作用有关。血管紧张素Ⅱ最初发现时被作为一种具有血管收缩作用的多肽，但近些年的研究表明血管紧张素Ⅱ具有多方面的作用。如上所述，血管紧张素Ⅱ可通过激活血管内皮细胞和平滑肌细胞上的ATl受体从而激活多种和炎症相关的信号转导通路，诱导多种致炎因子的产生。尽管这些细胞学的研究多和血管内皮细胞和平滑肌细胞相关，但肺的血管内皮细胞本身就在各种急性肺损伤(包括VILI)的致病机制中发挥重要的作用。当然，血管紧张素Ⅱ及其受体是否在肺上皮细胞的炎症反应中发挥作用还需更进一步研究。除了炎症反应外，血管紧张素Ⅱ还在氧化应激和细胞凋亡中发挥重要作用。研究发现，血管紧张素Ⅱ能促进白细胞等的氧化应激反应，加重炎性损伤。Wang等研究表明，血管紧张素Ⅱ还可诱导肺上皮细胞等的凋亡。因此，Losartan对VILI的保护作用可能还和其阻断血管紧张素Ⅱ的促进氧化应激和细胞凋亡作用有关。总之，血管紧张素Ⅱ在炎症、细胞凋亡以及氧化应激反应等多方面均起着一定的作用，Losartan对VILI的保护作用可能与上述这些方面有一定联系。

总之，本研究发现，VILI时血管紧张素Ⅱ的表达水平显著增高，特异性阻断ATl受体能显著减轻VILI时急性肺损伤的程度。