脑缺血后髓鞘基因表达变化的规律

陈应柱　鲍　欢　田　野　包仕尧　许　俊　袁成林

【摘要】目的从髓鞘碱性蛋白(MBP)mRNA、髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG)mRNA等髓鞘基因表达的角度，探讨脑缺血大鼠髓鞘损伤的变化规律。方法采用SD大鼠四血管闭塞急性全脑缺血模型，随机分为2 d、4 d、7 d、14 d和28 d五个时间点及假手术组，每组8只；用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)观察海马组织中MBP mRNA、MOG mRNA表达的变化。结果脑缺血后2 d海马组织中MBP mRNA、MOG mRNA表达水平即已降低，至7 d时降低显著，并持续至28 d时达到高峰。与假手术组比较，大鼠海马组织内MBP mRNA、MOG mRNA表达于再灌流后7 d、14 d、28 d差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论随着脑缺血一再灌流时间延长，大鼠海马组织MBP mRNA、MOG mRNA表达逐渐降低，呈现时间依赖性。

【关键词】髓鞘基因；全脑缺血；海马；逆转录聚合酶链式反应

急性缺血性神经元损伤的病理生理学机制已经得到了深入研究，但神经胶质细胞的缺血性损伤却很少受到关注。针对神经元损伤的神经保护剂在卒中临床试验中不能改善患者的预后，而少突胶质细胞对缺血缺氧具有选择易损性，因此有必要对少突胶质细胞缺血性损伤进行深入研究。本实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT，PcR)方法，从髓鞘基因表达的角度，探讨脑缺血大鼠髓鞘损伤的变化规律，旨在为缺血性脑损伤的临床防治提供依据。

1材料与方法

1．1实验设计及动物分组

健康雄性SD大鼠70只，由苏州大学医学院实验动物中心提供，体重200～240 g。采用大鼠四血管闭塞急性全脑缺血模型，剔除死亡和造模不成功的大鼠后，随机分为2 d、4 d、7 d、14 d和28 d五个时间点，每组8只；同时设立假手术组8只。

1．2主要试剂

Trizol为美国CHEMICON公司产品，MBP引物、MOG引物、β-actin引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成，其余分子生物学相关试剂均购自上海申能博彩公司。

1．3大鼠全脑缺血模型的制备及取材

采用Pulsinelli法建立大鼠急性全脑缺血模型，具体方法见文献报道。各组大鼠于相应时间点用20％乌拉坦过深麻醉后，经左心室常规灌注生理盐水，开颅取脑。分离出一侧海马组织立即置入无RNA酶的1.5 ml Ep管中并置于－70℃冰箱中备用。

1．4RT-PCR检测MBP mRNA、MOG mRNA的表达水平

1．4．1Trizol法提取总RNA样品中加入1 mlTrizol混匀后，按一步法步骤抽提总RNA。紫外分光光度计测定RNA含量，加DEPC水将RNA稀释到相同质量浓度(0.5μg／μl)。

1．4．2逆转录合成cDNA 2 μg RNA以0.2 μg Oligo(dT)18为引物，15μl反应体系在PCR仪上70℃预变性5 min，然后加入5×RT Buffer 8μl、dNTP1.25μl、RNasin 20 U、MMLV 200 U和DEPC水共40 μl体系，37℃60min，95 ℃ 5 min，然后4℃保存。

1．4．3PCR扩增取5 μl cDNA用于扩增。50 μl反应体系中加入10×Buffer 5 μl、MgCl₂ 4μl、dNTP1 μl、TaqDNA聚合酶2.5 u、正义和反义引物各1μl和水。

MBP引物上游序列为5-TCC GGA G GT TCAGGT GCA CG-3，下游序列为5-CTG GAC TCTCAC AGC TGC CC-3，扩增片段长292 bp。

β-actin引物上游序列为5-CTC CTF AAT GACCTC GCC ATC CC-3，下游引物序列为5-GATCTF GAT CTF CAT GGT GCT AGG-3，扩增片段长764 bp。扩增条件：94℃4 min，接94℃45 s，60℃退45 s，72℃1 min，循环30次后接72℃ 延伸7min。

MOG引物上游序列为5一CCG GGC TIT AGTTGG GGA TGA-3，下游序列为5-CAC GGC GGCTrC 1TC TFG GTA G－3，扩增片段长236 bp。

β-actin引物上游序列为5-GAG AGG GAAATG TGG TGA－3，下游引物序列为5－CAT CTGCTG GAA GGT GGA CA-3，扩增片段长452 bp。扩增条件：94℃4 min，接94℃45 s，60℃退火45s，72℃1 min，循环30次后接72℃延伸7 min。

1．4．4结果分析以β-actin为内参照，取目的基因和β-actin扩增产物6μl在1％琼脂糖凝胶平板上电泳，结果用计算机数字扫描密度影像分析仪进行半定量分析。

1．5统计学方法

以内参照β-actin吸光度值标化MBP和MOG吸光度值，得到相应基因表达的相对含量。数据采用均数±标准差(χ±s)表示，应用SPSS 11.5统计软件对资料进行分析。组问均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1不同缺血．再灌流时间MBP mRNA的变化

大鼠全脑缺血-再灌流后海马组织内MBPnRNA表达随着再灌流时间延长而降低，2 d时即已降低，但与假手术组差异无统计学意义，至7 d时显著降低，并持续至28 d时达到高峰。与假手术组比较，大鼠海马组织内MBP mRNA表达于再灌流后7 d、14 d、28 d差異具有统计学意义(P＜0.05)。

2．2不同缺血-再灌流时间MOG mRNA的变化

MOG mRNA表达变化与MBP mRNA相似。MOG mRNA表达随着再灌流时间延长而降低，2 d时即已显著降低，与假手术组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，至14 d时降低明显(P＜0.01)，并持续至28 d时达到高峰。从表达相对含量的数值可见假手术组表达维持在较高水平，全脑缺血后表达下调，至14 d时仅为假手术组的50％～60％(P＜0.01)。MOG mRNA表达呈时间依赖性下调。

3讨论

不管何种临床类型的缺血性脑卒中，大多数情况下急性脑缺血都将影响到脑白质。然而对灰质缺血性损伤的研究却比白质要深入的多。实际上白质对缺血缺氧有选择易损性。许多证据支持少突胶质细胞在某一发育阶段对缺血缺氧有高度敏感性这一假说。脱髓鞘是中枢神经系统缺血缺氧后最常见的病理改变之一。但脱髓鞘前的分子水平改变尚不清楚。海马是缺血易损伤区域之一，少突胶质细

胞主要分布于白质内，在海马及灰质中也可见，尤其是少突胶质前体细胞。少突胶质前体细胞在海马、皮质、白质中的分布密度是一致的，密度在88～140／mm²，海马中少突胶质细胞与其前体细胞的比值为1：1。基于这些原因，我们选择海马区作为实验对象来观察全脑缺血损伤后髓鞘基因表达的变化规律。MBP主要分布于致密髓鞘中，它的沉积被认为是髓鞘合成的精确指数，而MOG特异性存在于中枢神经系统髓鞘和少突胶质细胞，MOG主要表达于少突胶质细胞发育的晚期阶段，被认为是少突胶质细胞成熟的标记物。本实验采用SD大鼠四血管闭塞全脑缺血模型、RT-PCR技术检测MBP mRNA、MOG nRNA来研究脑缺血后髓鞘基因表达的变化。结果显示，海马区MBP mRNA和MOG mRNA表达在脑缺血后2 d即已有降低，且随着再灌流时间延长，基因表达水平逐渐降低，至7d时显著下降，并持续至28 d时。全脑缺血损伤后海马区MBP mRNA和MOG mRNA表达的显著降低清楚地表明大鼠缺血缺氧除造成神经元损伤外，也导致髓鞘基因表达的变化。这些现象提示缺血缺氧可造成严重的少突胶质细胞损伤。髓鞘的减少也许是少突胶质前体细胞丢失的结果，也可能与少突胶质细胞发育延迟造成功能不良有关。在缺血后7 d内所见的初期

MBP mRNA、MOG mRNA表达减少可能是少突胶质细胞早期凋亡的结果，而持续的表达减少则归因于少突胶质前体细胞凋亡，后者将引起少突胶质细胞得不到有效的补充。少突胶质前体细胞至成熟的少突胶质细胞的细胞周期大约4周。缺血可能导致出现少突胶质细胞明显减少的时间延迟。在发生早期的凋亡反应之后，由于这些细胞在中枢神经系统中的生存周期相对长，少突胶质前体细胞死亡后少突胶质细胞补偿减少，其最终结果将是脱髓鞘。因为本实验仅仅检测了全脑缺血后28 d内髓鞘基因表达的变化，目前尚不清楚髓鞘基因表达的减少是否会持续一段时间，或通过某种代偿机制使其表达恢复正常。

白质损伤的机制较为复杂，神经元损伤的发病机制不完全适用于白质损伤。已证实，几种机制在缺血缺氧性白质损伤中起重要作用。这些机制涉及血流量及其调节相关的许多因素以及凋亡、自由基形成、细胞因子和兴奋毒性释放等。作者认为不仅引发髓鞘基因表達变化的因素是多元性的，而且髓鞘基因表达变化将直接导致蛋白质损伤。

本实验结果支持在脑缺血缺氧过程中白质的主要成分——少突胶质细胞受到破坏的观点。缺血缺氧导致少突胶质细胞变性、髓鞘破坏及髓鞘基因表达异常。这意味着卒中后仅仅针对神经元死亡的病理生理学机制进行保护治疗并不能获得明显的疗效，但是若能在保护神经元的同时兼顾保护神经胶质细胞将有助于减轻神经功能的缺损。