蛋白激酶A在TGF-β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中的作用

张选奋　李荟元　鲁开化　郭树忠　李向东

张选奋男，1965年生。兰州医学院副教授、副主任医师。现在第四军医大学西京医院整形外科中心从师李荟元教授和鲁开化教授攻读博士学位。已发表论文16篇。

［摘要］目的：探讨蛋白激酶A在TGF-β₁刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(HS-FB和NS-FB)合成胶原中的信号转导作用。方法：利用³²P掺入底物法测定TGF-β₁刺激的HS-FB和NS-FB的PKA活性，³ H-脯氨酸掺入法和放射免疫法测定胶原合成能力。结果：NS-FB被TGF-β₁刺激后PKA的活性短暂升高后很快恢复，HS-FB则在30～60min降低(P＜0.05)。TGF-β₁对两种细胞有加速合成胶原的作用(30min后P＜0.05)，HS-FB的合成能力比NS-FB强(刺激60min后P＜0.05)。cAMP有抑制作用(60min后P＜0.05)，H7则有拟TGF-β₁作用(与对照比较时30min后P＜0.05)，而H7可增强TGF-β₁刺激的作用(30～60min时P＜0.05)。结论：TGF-β₁刺激两种细胞后PKA的活性变化提示cAMP/PKA通道参与介导TGF-β₁信号：TGF-β₁对HS-FB的短期刺激作用与PKA活性降低有关，但长期刺激作用与PKA通道活性变化无关；cAMP/PKA活化可以抑制FB合成胶原。［关键词］信号转导蛋白激酶A转化生长因子β₁成纤维细胞胶原合成

［中图分类号］R619+.6［文献标识码］A［文章编号］1008-6455(2001)01-0009-04

THE EFFECTS OF ACTIVITY OF PROTEIN KINASE A IN TGF-β₁ STIMULATING

COLLAGEN SYNTHESIS OF NORMAL SKIN AND HYPERTROPHIC SCAR FIBROBLASTS

ZHANG Xuan-fenLU Kai-huaLI Hui-yuan et al

Center of Plastic Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University.(Xian,Shanxi 710032)

［Abstract］Objective：To investigate the effects of protein kinase A(PKA)in TGF-β₁ stimulating collagen synthesis of normal skin and hypertrophic scar fibroblast(NS-FB and HS-FB).Methods：The activity of PKA of HS-FB and NS-FB was detected by 32P incorporation assay.Total collagen synthesis was measured by ³H-proline incorporation assay and radioimmunoassay.Results：The activity of PKA of NS-FB rose temporarily insigmificantly and recovered soon while the ones of HS-FB decreased and recovered at lh the stimulation of TGF-β₁(P＜0.05).TGF-β₁ could enhance collagen synthesis of FB(P＜0.05 at stimulating 30 minutes later) but the effects were stronger in HS-FB(〖WTBX〗P＜0.05 at stimulating 60 minutes later).cAMP could inhibit the changes (P＜0.05 at stimulation 60 minutes) while H7 could improve roles of TGF-β₁(P＜0.05 at 30～60minutes of stimulation).Conclusion：The changes of the PKA activity of the two types of cell after the stimulation of TGF-β₁ might implicate that there was difference in the PKA signal pathway.The effects of TGF-β₁ stimulating collagen synthesis might have partly relation to cAMP/PKA pathway but activating cAMP/PKA signal pathway could abrogate FB to synthesize collagen.

［Key words］Signal TransductionProtein Kinase ATGF-β₁FibroblastCollagen Synthesis

瘢痕增生是血管内皮细胞(Endothelial Cell,简称EC)^〔1〕、血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,简称VSMC)〔2，3〕和成纤维细胞(Fibroblast简称FB)^〔4〕等瘢痕形成相关细胞增埴加速和合成大量细胞外基质所致。转化生长因子β₁ (TGF-β₁)能强烈刺激FB、EC和VSMC等合成细胞外基质。而cAMP/PKA途径活化对许多细胞合成胶原等细胞外基质有抑制作用。先前我们研究了TGF-β₁刺激FB增殖中PKA所起的作用^〔5〕，本文的目的是研究TGF-β₁刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(Hypertrophic Scar Fibroblast,HS-FB和Normal Skin Fibroblast,NS-FB)合成胶原与PKA活性间的关系。

1材料和方法

1.1材料ケ瓯荆涸錾性瘢痕(HS)和正常人皮肤组织(各4例)来自我院手术病例。二者在年龄、性别和部位等方面匹配。原代培养用组织块法。实验用4～10代细胞。ナ约粒簂eupeptin、aprotanin、H7和PMSF购自sigma公司。PKA检测kit、cAMP和TGF-β₁购自Promega公司。蛋白质定量kit购自Bio-RAD公司。³ H-脯氨酸购自北京原子能研究院。［-32 P］ATP(3000ci/m mol)购自北京亚辉生物公司。Ⅲ型前胶原测定试剂盒购自重庆肿瘤研究所。DMEM购自Hyclone公司。其它试剂均为分析纯或更纯。ヒ瞧鳎築eckman GS-15R冷冻高速离心机；Polytron 超声匀浆仪；Beckman LS6500液闪仪；Perkin Elmer Lambda14紫外可见光分光光度计等。

1.2方法

1.2.1PKA活性测定TGF-β₁刺激的时间为10、30、60和120min，按我们先前的方法^〔5〕测定。

1.2.2胶原合成测定³ H-脯氨酸掺入实验：接种细胞2.5×107/ml(10%胎牛血清的DMEM制备细胞悬液)于96孔板，每孔100μl，置于5%CO₂，100%湿度，37℃培养48h。0.5%胎牛血清的DMEM饥饿细胞24h。分别用0.5%胎牛血清的DMEM稀释的TGF-β₁5ng/ml、H7250μM、cAMP0.025mM和TGF-β₁5ng/ml+H7 250μM刺激10、30、60和120min，0.5%胎牛血清的DMEM为阴性对照。刺激后吸弃上清液，直接加入100μl³ H-脯氨酸5m ci/L(含维生素C 50mg/L、β₁-氨基丙腈100mg/L和10%胎牛血清的DMEM)，培养24h，弃上清，消化细胞，多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维纸上，加闪烁液，液闪计数。ゴ送猓为了研究较长时间刺激的效应，我们还做了刺激12h和24h的反应。ド锨逡呵阿笮徒涸(PCⅢ)测定：细胞培养和刺激与³ H-脯氨酸掺入实验相同。刺激后，10%胎牛血清的DMEM培养48h，小心吸取培养上清液，-20℃保存，两周内检测。检测时，于1.5ml离心管中加入上清液100μl和人PCⅢ抗体200μl，4℃放置20h，加125I-hPCⅢ100μl，4℃放置6h，加分离剂(混匀后)200μl，室温30min，1400g离心30min，吸弃上清液，沉淀物作放射计数。查标准曲线即可得到PCⅢ的浓度。

2结果

2.1PKA活性变化TGF-β₁刺激后PKA的活性变化见图1。TGF-β₁刺激NS-FB后PKA的活性短暂升高，30min内恢复，但P＞0.05；而HS-FB被刺激后酶活性降低(30～60min时P＜0.05)，1h内恢复到对照水平。

图1TGF-β₁刺激HS-FB和NS-FB后PKA的活性变化

2.2胶原合成能力测定结果³ H-脯氨酸掺入结果：见图2和图3。TGF-β₁可增强两种细胞的胶原合成(30min后〖WTBX〗P＜0.05)，TGF-β₁对HS-FB的刺激作用强于NS-FB(刺激60min后P＜0.05)。而cAMP则有抑制作用(60min后P＜0.05)，H7有拟TGF-β₁作用(与TGF-β₁比较：P＞0.05，与对照比较：30min后〖WTBX〗P＜0.05)，且H7可以部分增强TGF-β₁刺激的作用(30～60min时P＜0.05)。TGF-β₁等作用后两种细胞合成胶原能力在各时间点没有显著性差异。

上清液PCⅢ测定结果：见附表。不同时间刺激后PCⅢ的浓度变化规律与³ H-脯氨酸掺入实验一致。

3讨论

创伤后组织修复过程有多种细胞因子和多种细胞参与。细胞因子作用于细胞后其增殖、分化、运动、凋亡、合成和分泌细胞外基质等生物学行为变化已有较多的研究。在这些研究中，细胞因子刺激后细胞内(胞膜、胞浆和胞核)的变化过程被作为"黑箱"处理而未予研究。但是，在体内细胞处于的相当复杂的微环境中，众多因素的共同刺激如何引起细胞行为变化?细胞对众多的刺激是如何处理的?这必然涉及细胞外刺激信号在细胞内传导的过程。cAMP/PKA信号通道是较早发现的细胞内信息代谢途径之一。PKA为依赖cAMP的蛋白激酶，广泛存在于各种细胞内，其活性主要受胞内cAMP浓度的影响。毛喉素(Forsklin)活化腺苷酸环化酶和IBMX(3-isobutyl-1-methyl-xanthene)、茶硷等抑制磷酸二酯酶而提高cAMP浓度，此外，一些cAMP的类物如8-溴-cAMP、dcAMP(dibutyryl cAMP)等也有拟cAMP作用。生理性的失活主要是被磷酸酶脱磷酸化。已经发现H7、H-89或其假底物肽m-phi等可抑制PKA活化。胞外的多种刺激也可活化或抑制PKA的活性。PKA活化后能影响细胞蛋白的磷酸化而改变细胞膜的通透性，调控细胞的增殖、运动、合成和分泌物质如胶原等细胞外基质等。Berman^〔6〕等发现己酮可可硷(Pentoxifylline PTX)能全面抑制皮肤FB合成胶原、糖胺聚糖和FN，还增加胶原酶活性而发挥抗纤维化的作用。近年来，Chen^〔3〕等也证实PTX呈cAMP依赖性抑制bFGF和PDGF-AB诱导的VSMC表达前胶原Ⅰ(α₁)和前胶原Ⅲ(α₁)mRNA，也抑制TGF-β₁引起的胶原合成。8-溴cAMP和毛喉素能模仿PTX的作用而H-89、m-phi PKA能阻断PTX的作用；显然，PTX的作用经由cAMP/PKA通道介导。ノ颐堑慕峁也支持这些观点：cAMP可抑制HS-FB和NS-FB的胶原合成和释放而H7则有促进作用，且H7还能增强TGF-β₁的短期刺激作用，而此时正好是TGF-β₁刺激HS-FB后PKA活性降低的时期。这提示活化和抑制PKA分别有抑制和增强HS-FB合成和释放胶原的作用。尽管TGF-β₁刺激NS-FB后短期内轻度升高PKA活性而NS-FB合成和释放胶原增多，而cAMP和H7对NS-FB的作用与HS-FB完全一致，提示PKA不是主要的TGF-β₁的信号转导者。TGF-β₁刺激HS-FB后PKA活性相反变化的原因尚进一步研究。TGF-β₁的信号主要通过TGF-β₁受体-SMAD璼转导^〔7〕，TGF-β₁对FB胶原合成的刺激是否经此途径转导，也须深入研究。ブ谒周知，多数生长因子如EGF、FGF和PDGF等信号主要通过受体酪氨酸蛋白激酶(Receptor Tyrosine Protein Kinase,RTPK)-Ras…Raf-1…MAPK(丝裂原活化的蛋白激酶Mitogen-Activated Protein Kinase)通道^〔8〕传递，刺激细胞增殖和合成大量的细胞外基质，这既是修复的基础，又是瘢痕增生的原因，该通道和cAMP/PKA通道间的"交谈(cross-talk)"起负反馈作用。DAnglo^〔1〕等发现cAMP能阻止VEGF和bFGF诱导的Raf-1活化，而H-89能逆转cAMP/PKA活化对MAKP活化和丝裂原诱导的细胞增殖的抑制作用。Graves^〔2〕等发现PDGF-BB能呈剂量依赖性升高cAMP和PKA活性，并可被磷酸二酯酶抑制剂增强，可见生长因子活化Raf的同时也活化cAMP/PKA，而cAMP/PKA活化可抑制Raf-1，从而使MAPK不能活化而抑制丝裂原和/或生长因子刺激效应。形成负反馈抑制^〔9〕。这强烈提示活化PKA通道可能有助于抑制或阻止瘢痕的过度增生。而我们先前的研究发现增生性瘢痕疙瘩组织中PKA活性没有变化〔10〕，提示瘢痕增生可能与PKA不能活化而未起副反馈抑制有关。パ芯恐な担琧AMP/PKA通道活化产生的生物学效应因细胞种类、分化和功能状态而异。Calleja^〔4〕发现cAMP/PKA通道可抑制MAPK而抑制FB增殖，而对PC12细胞则促进增殖；同时还发现表达神经生长因子受体的FB(NIH3T3)和表达胰岛素受体的FB(NIH3T3)间也存在一些差异。这可能与细胞参与转导信号的PKA亚型有关〔11〕。进一步研究FB等与瘢痕形成有关的细胞被有关刺激因子刺激后PKA亚型的变化以及与细胞生物学效应间的关系有助于阐明PKA通道在瘢痕形成中相关细胞的作用。バ枰指出的是，我们的结果与先前关于增殖的研究一致^〔5〕，提示TGF-β₁和PKA通道对FB的增殖和胶原合成的影响是同步的。两种不同来源的细胞在许多方面是极其相似的，可能HS-FB来自于NS-FB，仅前者的个别行为较后者略强而矣。ヒ虼耍我们认为，TGF-β₁刺激FB合成胶原可能与PKA活性变化有关，而活化PKA则可能有抑制FB合成胶原作用，采用提高胞内cAMP水平可用于防治增生性瘢痕。

［参考文献］

1DAngelo G,Lee H,Weiner RI. cAMP-dependent protein kinase inhibitors the mitogenic action of vascular endothelial growth and fibroblast growth factor in capillary endothelial cells by blocking Raf activation［J］.J Cell-Biochem,1997;67(3):353～366

2Graves LM,Bornfeldt KE,Sidhu JS,et al.Platelet-derived Growth factor stimulates protein kinase A through mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in human arterial smooth muscle cells［J］. J Biol Chem,1996;271:505～511

3Chen YM,Wu KD,Tsai TJ,et al.Pentoxifylline inhibits PDGF-induced proliferation of and TGF-beta-stimulated collagen synthesis by vascular smooth muscle cells［J］.J Mol-Cell-Cardiol,1999;31(4):773～783

4Calleja V,Enriquez PR,Filloux C,et al.The effect of cyclic adenosine monophosphate on the mitogen-activated protein kinase pathway depends on both the cell type of tyrosine kinase-receptor［J］.Endocrinology,1997;138:1111～1120

5张选奋，鲁开化，李荟元等.蛋白激酶A在TGF-β₁刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞增殖中的作用［J］.中国美容医学杂志，2000；9(6)：413

6Heldim CH,Miyazomo K,ten Dijde P.TGF-β signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins［J］.Nature,1997;390:465～471

7Berman B & Duncan MR.Pentoxifylline inhibits normal human dermal fibroblast in vitro proliferation,collagen,glycoaminoglycan and fibronectin production and increases collagenase activity［J］. J Invest Dermatol,1989;92:605～610

8Scott PG,Dodd CM,Tredget EE,et al.Immunohistochemcal localization of the proteoglycans decorn,biglycan and versican transforming growth factor-beta in human post-burn hypertrophic and mature scars［J］.Histopathology,1995;26:423～431

9Cook SJ,McCormick F.Inhibition by cAMP of Ras-dependent activation of Raf［J］.Science,1993;262:1069～1072

10张选奋，鲁开化，李荟元等.瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织中PKA活性测定［J］.第四军医大学学报(待发表)

11Chen TC,Hinton DR,Zidovetzki R,et al.Up-regulation of the cAMP/PKA pathway inhibits proliferation,induces differentiation and leads to apoptiosis in malignant gliomas［J］.Lab Invest,1998;79(2):165～174

收稿日期2000-10-10

编辑/樊延南