蛋白激酶A在转化生长因子β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞增殖中的作用

2000-06-14 02:17张选奋鲁开化等
中国美容医学 2000年6期
关键词:纤维细胞生长因子活化

张选奋 鲁开化等

张选奋鲁开化李荟元郭树忠李向东

(第四军医大学西京医院整形外科中心西安710032)

张选奋 男,1965年生。兰州医学院副主任医师,副教授。现在第四军医大学西京医院整形外科中心从师鲁开化教授和李荟元教授攻读博士学位,已发表论文15篇。

[摘要]目的:探讨蛋白激酶A在转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(HS-FB和NS-FB)增殖中的信号转导作用。方法:利用32P掺入底物法测定HS-FB和NS-FB的PKA活性;使用直接计数法和MTT法测定TGF-β1和cAMP、H7等刺激两种细胞后增殖能力的变化。结果:NS-FB被TGF-β1刺激后PKA的活性短暂升高后很快恢复(30min内,但P>0.05),HS-FB则在30~60min降低(P<0.05),1h后恢复;HS-FB的PKA活性比NS-FB低(但P>0.05)。TGF-β1能强烈刺激两种细胞增殖(30min后P<0.05),对HS-FB的刺激作用更强(刺激60min后P<0.05)。cAMP可抑制两种细胞增殖(60min后P<0.05),H7有拟TGF-β1作用(30min后P<0.05),H7还可增强TGF-β1的刺激作用(30~60min后P<0.05)。结论:TGF-β1刺激后PKA的活性在两种细胞有不同的变化,提示两种细胞的cAMP/PKA信号通道存在一定的差异;TGF-β1刺激作用部分经PKA活性变化介导,但活化PKA通道可以逆转TGF-β1的作用。

[关键词]信号转导蛋白激酶A转化生长因子-β1成纤维细胞增殖

[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2000)06-0413-04

THE EFFECTS OF ACTIVITY OF PROTEIN KINASE A IN TGF-β1 STIMULATING

PROLIFERATION OF NORMAL SKIN AND HYPERTROPHIC SCAR FIBROBLAST

ZHANG Xuan-fenLU Kai-huaLI Hui-yuan et al.

Center of Plastic Surgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University(Xian 710032)

[Abstract]Objective:To investigate the effects of protein kinase A(PKA)in TGF-β1 stimulating proliferation of normal skin and hypertrophic scar fibroblast(NS-FB and HS-FB).Methods:The activity of PKA of HS-FB and NS-FB was detected by 32P incorporation assay.Cell proliferation was measured by methyltetrazolium assay and cell count after TGF-β1,cAMP and H7 stimulating.Results:The activity of PKA of NS-FB was risen temporarily insignificantly and recovered soon while the one of HS-FB was decreased and recovered at lh the stimulation of TGF-β1 (P<0.05).TGF-β1 could stimulate proliferation of FB(P<0.05 at stimulating 30 minutes later) but the effects were stronger in HS-FB(P<0.05 at stimulating 60 minutes later).cAMP could inhibit the changes (P<0.05 at stimulating 60 minutes later) while H7 could improve roles of TGF-β1(P<0.05 at 30~60 minutes of stimulation).Concusion:The changes of the PKA activity of the two types of cell after the stimulation of TGF-β1 might implicate that there was difference in the PKA signal pathway. The effects of TGF-β1 stimulating cell proliferation might have partly relation to cAMP/PKA pathway but the activation of cAMP/PKA signal pathway could abrogate the effects of TGF-β1.

[Key words]Signal transductionPKATGF-β1FibroblastProliferation

环磷酸腺甙(cyclic Adenosine Monophosphate简称cAMP)--蛋白激酶A(Protein Kinase A,PKA)信息途径活化对许多细胞如血管内皮细胞(Endothelial Cell,EC)〔1〕、血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)〔2,3〕和成纤维细胞(Fibroblast,FB)〔4〕等瘢痕形成相关细胞有促进分化和凋亡、抑制增殖作用。转化生长因子β1(transforming growth factor β1 简称TGF-β1)刺激能强烈加速FB、EC和VSMC等细胞增殖。尚不清楚TGF-β1对增生性瘢痕和正常人皮肤成纤维细胞(Hypertrophic Scar Fibroblast,HS-FB 和Normal Skin Fibroblast,NS-FB)的cAMP/PKA通道的影响以及cAMP/PKA 通道在FB增殖中的作用。我们做了研究,报道如下。

1材料和方法

1.1材料

标本:原代培养HS和正常人皮肤组织(各4例,均系我院手术病例)。二者在年龄、性别和部位等方面匹配。细胞成片后传代。实验用4~10代细胞。

试剂:leupeptin、aprotanin、H7、MTT和PMSF购自sigma公司。PKA检测kit、cAMP和TGF-β1购自Promega 公司。蛋白质定量kit购自Bio-RAD公司。ATP(3000ci/m mol)购自北京亚辉生物公司。DMEM购自Hyclone公司。其它试剂均为分析纯或更纯。

仪器:Beckman GS-15R冷冻高速离心机;Polytron 超声匀浆仪;Beckman LS6500液闪仪;Perkin Elmer Lambda14紫外可见光分光光度计和Labsystems Dragon 公司Wellscan MK2型酶标仪等。

1.2方法

1.2.1PKA活性测定

酶样准备:细胞置25cm培养瓶用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的 DMEM常规培养48h,0.5%FBS的DMEM饥饿24h,TGF-β15ng/ml、H7 250μM、cAMP0.025mM和TGF-β15ng/ml加H7 250μM刺激10、30、60和120min,冰浴上用细胞刮刀收集细胞,立即置液氮中冻存。

冰浴上融化细胞,加入预冷的样品缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.4,0.5mM EDTA,0.5mM EGTA,10mM β-巯基已醇,1μg/ml leupeptin,lμg/ml aprotanin, 5mM PMSF)500μl,预冷的涡旋混合仪和超声匀浆仪混匀和匀浆,14000g离心5min,留上清液作为酶样。操作均在0~4℃进行。

PKA活性测定:按试剂盒说明进行。按0.5mM ATP 5μl和[-32p]ATP(3000ci/m mol)10ci/μl 0.05μl准备ATP混合物并混匀。反应总体积为25μl。PKA测定缓冲液5×(200mM Tris-HCl pH7.4,100mM MgCl2,0.5mg/ml BSA)、PKA多肽底物、[-3232p]ATP混合物和去离子水各5μl,混匀。空白反应用去离子水代替PKA底物。30℃温育5min,加酶样5μl启动反应,准确30℃温育5min(温育时间、酶样要否稀释由预实验确定)。加12.5μl终止缓冲液终止反应。每样品均为双复管。点反应混合液10μl到SAM2M膜,依次洗膜:2M NaCl 200ml 30sec1次,2M NaCl 200ml 2min2次,含1%磷酸的2M NaCl 200ml 2min3次,100ml去离水30sec 2次,共约12~15min。另外,任取两个反应液各5μl点到SAM2M膜但不洗。所有膜均在室温干燥。置膜于液闪瓶,加闪烁液2ml后液闪计数。

蛋白质含量测定和结果计算按试剂盒说明进行。

1.2.2增殖能力测定

MTT实验:接种细胞2.5×107/ml(10% FBS 的DMEM制备细胞悬液)于96孔板,每孔100μl,常规培养48h。0.5% FBS的DMEM饥饿细胞24h。刺激与PKA测定相同。0.5% FBS的DMEM为阴性对照。刺激后,换用0.5% FBS的DMEM培养20h,每孔加MTT(5mg/ml)溶液10μl,继续培养3h,小心吸弃上清液,每孔加二甲基亚砜150μl,振荡10min显色,在490nm测吸光值。

细胞计数:细胞培养和刺激与MTT比色实验相同,仅在刺激后再培养20h,胰酶消化,准确定量的DMEM稀释成细胞悬液,血球计数板计数,取三复孔计数两次的平均值。

此外,为了研究长时间刺激的效应,我们还做了刺激12h和24h的反应。

2结果

2.1PKA活性变化

TGF-β1刺激后PKA的变化见。与对照相比,TGF-β1刺激NS-FB后PKA的活性有短暂的升高(10min后升高,30min内恢复,但P>0.05);而HS-FB被刺激后酶活性降低(30~60min时P<0.05),1h内恢复到对照水平;对照组HS-FB的酶活性均高于NS-FB,但无统计学差异(P>0.05)。

2.2增殖能力变化

2.2.1细胞数量TGF-β1可增强两种细胞的增殖能力(30min后P<0.05),TGF-β1刺激后HS-FB的增殖能力高于NS-FB(60min后P<0.05),cAMP能抑制两种细胞增殖(60min后P<0.05,)H7则有拟TGF-β1作用(与TGF-β1比较时P>0.05,与对照比较时30min后<0.05),而H7部分增强TGF-β1的刺激作用(30~60min时P<0.05)。cAMP、H7和TGF-β1+H7三种刺激在HS-FB和NS-FB间差异不明显(P>0.05)。(见表1)

3讨论

PKA为依赖cAMP的蛋白激酶,有转递胞外的刺激信号、影响膜蛋白的磷酸化而改变细胞膜的通透性、调节细胞的增殖、分化和凋亡等作用。一般认为,cAMP/PKA通道活化可以促进细胞分化和凋亡,抑制增殖。PKA主要被cAMP活化。毛喉素(Forsklin)活化腺苷酸环化酶和IBMX(3-islbutyl-l-methyl-xanthene)、茶硷等抑制磷酸二酯酶可提高cAMP浓度而活化PKA,cAMP的类似物如8-溴-cAMP、dbcAMP(dibutyryl cAMP)等有拟cAMP作用而另一些则有抗cAMP作用。PKA可被H7、H-89或假底物肽m-phi 等抑制,但生理性的失活是被磷酸酶脱磷酸化。Berman〔5〕等发现己酮可可碱(Pentoxifylline,PTX)能全面抑制皮肤FB的增殖,还增加胶原酶活性而发挥抗纤维化的作用。近来,Chen〔3〕等也证实PTX呈cAMP依赖性抑制bFGF和PDGF-AB诱导的VSMC的增殖,8-溴cAMP和毛喉素能模仿PTX的作用而H-89和m-phi PKA能阻断PTX的作用;显然,PTX的作用经由cAMP/PKA通道介导。我们的结果发现TGF-β1刺激NS-FB后PKA的活性短暂升高(10min后升高,30min内恢复);而HS-FB则先降低,1h内恢复到对照水平;提示cAMP/PKA通道可能参与TGF-β1短期刺激FB增殖,但不是TGF-β1信号主要介导者。TGF-β1能刺激两种细胞增殖,支持先前的研究〔6〕。而cAMP能抑制两种细胞增殖,H7有拟TGF-β1作用,而H7可增强TGF-β1刺激的作用,这提示PKA活化可能抑制FB的增殖。TGF-β1刺激HS-FB和NS-FB后PKA活性相反变化的机理尚待进一步研究。

cAMP/PKA信号通道活化后抑制FB等细胞增殖的机理可能涉及细胞内的多条信号通道。cAMP/PKA通道和生长因子-受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Protein Kinase,R-TPK)-Ras…Raf-1…MAPK(丝裂原活化的蛋白激酶 Mitogen-Activated Protein Kinase)通道〔7〕的"交谈(cross-talk)"可能是机制之一。DAnglo〔1〕等发现cAMP能阻止VEGF和bFGF诱导的Raf-1活化,而H-89能逆转cAMP/PKA活化对MAKP活化和丝裂原诱导的细胞增殖的抑制作用。Graves〔2〕等发现PDGF-BB呈剂量依赖性升高cAMP和PKA活性,并可被磷酸二酯酶抑制剂增强,可见生长因子活化Raf的同时也活化cAMP/PKA,而cAMP/PKA活化可抑制Raf-1,从而不能活化MAPK而抑制丝裂原和/或生长因子刺激的细胞增殖,形成负反馈抑制〔8〕。此外,近年来发现PKA还能阻止佛波酯-蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)活化介导的细胞增殖并证实主要经抑制c-jun、c-fos mRNA表达发挥作用〔9〕。cAMP/PKA活化还促进细胞分化和凋亡。还有,PKA可直接使细胞分裂终止在G1-G2期和cAMP诱导P27kipl(周期素依赖性激酶4-Cyclin-Dependent Kinase,CDK4-的抑制剂)产生而阻止CDK4的活化,使细胞停止在G1〔10,11〕以及cAMP/PKA的对糖-能量代谢的影响都是可能的机制。TGF-β1增加HS-FB的细胞数量可能部分与降低PKA活性而弱化对增殖抑制和减弱凋亡有关。

然而,近年来发现,cAMP/PKA可刺激一些细胞增殖。Calleja〔4〕发现cAMP/PKA通道的细胞增殖的影响:对FB经抑制MAPK而抑制增殖,而对PC12细胞则促进增殖。这可能与不同细胞的信息代谢过程存在差异和细胞内PKA亚型等有关〔12〕

综合上述,TGF-β1刺激FB使PKA活性变化和cAMP和H7对FB增殖的影响提示PKA信号通道参与瘢痕形成相关细胞如FB、EC、VSMC、表皮细胞和炎症细胞等在创伤愈合和瘢痕增生过程。弄清这些细胞的cAMP/PKA信息代谢通道变化,可能有助于了解瘢痕形成机理;干预此通道也可能预防和治疗瘢痕;使用升高cAMP或/和PKA活性的药物如氨茶碱、PTX和β受体阻滞剂等可能有预防瘢痕增生作用。

[参考文献]

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12、Chen TC,Hinton DR,Zidovetzki R,et al.Up-regulation of the cAMP/PKA pathway inhibits proliferation,induces differentiation and leads to apoptisis in malignant gliomas[J].Lab Invest,1998;79:165~174收稿日期2000-09-06

编辑/樊延南

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