增生性瘢痕形成过程中P53蛋白的增殖调控作用

鲁峰 高建华 黎小间

鲁峰高建华黎小间鲁峰，男，1975年出生，第一军医大学97级硕士研究生，从师南方医院整形外科高建华教授从事病理性瘢痕病因学研究，发表论文近10篇。

摘要目的：从成纤维细胞增殖调控水平，探讨增生性瘢痕过度增长的细胞生物学机理。方法：取正常皮肤和增生性瘢痕各６例为标本，通过细胞培养6～10代后,应用流式细胞仪、粘附式细胞仪检测不同来源的成纤维细胞、P53蛋白的表达和细胞周期的分布。结果:正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期(G0、G1期)且P53蛋白的表达较高;增生性瘢痕成纤维细胞p53蛋白的表达较低,大量细胞处于增殖状态(G2期、S期和M期)。结论:成纤维细胞细胞周期的分布及P53蛋白表达的差异可能是导致增生性瘢痕有别于正常皮肤呈现过度增生生长的细胞生物学机理之一。

关键词增生性瘢痕P53细胞周期

THE DISTRBUTION OF CELL CYCLE AND EXPRESSION OF P53 PROTIEN

ON FIBROLASTS DERIVED FRON THE HYPERTROPHIC SCARS AND NORMAL SKINS

Lu Feng,Gao jianhua,Li Xiaojian

Department of Plastic Surgery,Nanfang Hospital of the First Military Medical University (Guangzhou 510515)

Abstractpurpose:To explore the conctete machanism which account for the different growth characterists of the normal skins and hypertrophic scars.Methods:Six samples of normal skins and hypertrophic scars were collected.The means of cell culture was used,and only 6-10 passages fibroblasts were selected for experiment.The distributions of cell cycle and expression of protein P53 were analysed with the help of the flow cytometer and adherent cell analysis and sorting interactive laser coytometer(ACAS 570).Result:Alarge percent of fibroblasts derived from the hypertrophic scars distribute in G2、S and M periods with low levels of the P53 protein.On the other hand,fibroblasts derived from the normal skins distribute mostly in G0 and G1 period with a high expression of P53 protein.Conclusion:The difference of the distributions of cell cycle and expression of protein P53 may account for the propagative growth characteristic in the pathlogical scars and normal skins.

Key wordsHypertrophic scarP53Cellcycle

瘢痕增生是组织创伤后的异常修复,是美容医学基础研究的重要课题。其具体形成机制至今不完全清楚。其组织学特点是病变部位胶原的过度沉积及成纤维细胞的聚集⁽¹⁾。成纤维细胞是病理性瘢痕形成的功能性细胞,过度增殖的成纤维细胞和沉积的胶原导致局部瘢痕组织明显增生⁽²⁾。サ贾虏±硇择：鄢上宋细胞过度增生的主要原因可能是增殖-凋亡调控的失衡。那么,这种异常的增殖-凋亡又是由哪些基因来调控的呢?目前仍缺乏这方面的研究。本研究试图通过分析不同来源成纤维细胞的细胞周期分布及主要周期调控基因P53的表达,旨在从增殖调控水平初步探讨导致病理性瘢痕形成的细胞生物学机理。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1本实验所有瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均取自南方医院整形外科手术患者,均经临床及病理诊断证实。增生性瘢痕患者6例,男4例,女2例,病变部位分别位于足背、面部及肘部;年龄20岁～35岁;同时取增生性瘢痕患者供皮区正常皮肤为对照。

1.1.2培养基P53单克隆抗体为美国santa cruze公司产品,胎牛血清为美国Hyclone公司产品,DMEM培养基(Dulbeccos modified minimal essential medium,美国GIBCO生产)碘化丙啶(propidium odide,PI)荧光染料为美国Sigma公司产品。

1.2方法

1.2.1成纤维细胞的培养将手术切下的正常皮肤、瘢痕疙瘩和增生性瘢痕组织在无菌条件下切除其表皮,在少量胎牛血清中将标本切成1mm.3左右的组织块置于培养瓶中,在95%空气,5%二氧化碳、37℃、饱和湿度条件下培养6小时～8小时,使组织块牢固地粘附在瓶壁上,然后加入含15%胎牛血清的DMEM培养基适量,继续培养,3天～4天换液1次,2周～3周后,原代细胞生长成单层,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1∶3的比例传代培养,此后每2天～3天换液1次,每4天～5天分种传代1次,实验用第6代～10代细胞。

1.2.2流式细胞仪检测增生性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞细胞周期的分布ト「粘ぢ瓶壁的细胞,0.25%胰蛋白酶消化后收集于离心管中,1000rpm离心5min。PBS洗二遍,以70%冰乙醇固定细胞12小时以上,PBS离心沉淀去除固定液,加入500μl PI染液(含PI100μg/ml、Pnase 1mg/ml),37℃闭光孵育30分钟,在Coulter EPICS Elite(ESP)流式细胞仪上进行细胞DNA含量测定并分析细胞周期的分布。

1.2.3流式细胞仪检测增生性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞内P53蛋白的表达ト「粘ぢ瓶壁的细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后加入离心管内,1000转离心5min。PBS清洗后4%多聚甲醛固定30分钟以上。4℃2500转离心5min,PBS洗两遍,1%兔血清封闭非特异性抗原5min。PBS洗后,加入P53单抗50μl,4℃下过夜。PBS清洗后加入FTTC标记羊抗鼠的二抗。37℃水浴1h,PBS清洗两遍,200目筛孔过筛,应用Coulter EPICS Elite ESP流式细胞仪检测。

1.2.4粘附式细胞仪检测增生性瘢痕、正常皮肤成纤维细胞内P53蛋白的表达ト「粘ぢ瓶壁的细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后,加入适量含15%胎牛血清的DMEM培养基,吹打后按每皿含细胞1×10.5的密度接种到petri培养皿中,在95%空气,5%二氧化碳、37℃、饱和湿度条件下孵育8小时～10小时,使细胞完全贴壁并伸展呈梭形。将培养皿取出,室温下PBS液漂洗3次,4%多聚甲醛固定5-7min,PBS液漂洗3次后加入P53单抗20μe,37℃孵育30minPBS液漂洗3次后加入FITC标记的羊抗鼠的二抗,室温孵育30min,PBS液漂洗3次,加入少许PBS液后待检。ソ含已染色细胞的培养皿置于ACAS570交互式激光细胞仪(abherent cell analysis and sorting interactive lasercoytometer美国Meridian公司)载物台,直观地扫描测定细胞内染料初始荧光强度,得到细胞图象。选择待检测细胞,测定各细胞内荧光强度。荧光强度值代表所选单个细胞内抗原的含量。

1.2.5统计学分析ニ得数据用均数±标准差表示,统计处理应用SPSS软件,采用t检验进行比较分析。(附表)

2.结果

2.1流式细胞仪细胞周期分析结果显示:正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期(G0、G1期),处于增殖期的细胞占细胞总数的28%;增生性瘢痕成纤维细胞多数细胞处于增殖状态(G2期、S期和M期),处于增殖期的细胞占细胞总数的70%,两者之间差距显著(P<0.01)从周期分布的规律我们可以看出正常皮肤和增生性瘢部成纤维细胞的增殖能力和生长状况是有差别的。(图1～2)。

图1正常皮肤成纤维细胞细胞周期分布

显示:瘢痕疙瘩中央部成纤维细胞主要分布于静止期(G0+G1期),处于增殖期细胞百分率为30.0%。

图2增生性瘢痕成纤维细胞细胞周期分布

显示:瘢痕疙瘩周边部成纤维细胞大多数分布于增殖期(G2+S+M期),占细胞总数67%。

2.2正常皮肤成纤维细胞P53蛋白的阳性表达率较高为70%,增生性瘢痕成纤维细胞的阳性表达率很低仅为17%(图3～4)。两组间差异具有统计学意义(P<0.01)。

图3正常皮肤纤维细胞P53蛋白的分布

显示:正常皮肤成纤维细胞P53蛋白阳性表达率很高,为71.0%

图4增生性瘢痕成纤维细胞P53蛋白的分布

显示:增生性瘢痕成纤维细胞P53蛋白阳性表达率很低,为17.0%

2.3粘附式细胞仪实验结果与流式细胞仪检测结果吻合,P53蛋白阳性强度正常皮肤单个成纤维细胞较高而增生性瘢痕单个成纤维细胞较低(图5～6)。可见,正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞增殖能力和生长状况的差别可能是由不同表达强度的P53基因调控的结果。

图5正常皮肤单个成纤维细胞P53蛋白表达强度

粘附式细胞仪扫描图显示:正常皮肤单个成纤维细胞P53蛋白的荧光强度主要分布在2200左右。P53蛋白表达强度最强。

图6增生性瘢痕单个成纤维细胞P53蛋白表达强度

粘附式细胞仪扫描图显示:增生性瘢痕单个成纤维细胞P53蛋白的荧光强度主要分布在1000左右。P53蛋白表达强度最弱。

3.讨论ケ疚奈我们系列研究项目"病理性瘢痕成纤维细胞Fas介导的死亡信号的实验研究"之VI。细胞周期的分布可以直观地反应细胞群体的增殖状况,因此我们选择细胞周期作为观测指标对不同部位成纤维细胞增殖能力进行分析。ビτ昧魇较赴仪定量分析细胞周期的分布是近年来一项新的细胞学技术,能快速、准确地研究任何类型细胞的周期分布的规律.⁽³⁾。增殖期细胞内存在活跃的DNA的合成,因此胞内DNA含量大于两倍体细胞。此类细胞群包括G2期、S期和M期细胞。非增殖期细胞一般处于G1、G0期,因胞内DNA未复制,因此为典型的两倍体细胞群。因此,应用pI染料标记细胞内DNA后,流式细胞仪可对每个细胞内的DNA进行记录分析。结果经过统计后,可以见到两倍体的G1峰、四倍体的G2峰及两者间的S期细胞。经过电脑分析就可以了解一个细胞群体中增殖期及静止期细胞的百分率。ケ臼笛檠芯勘砻,正常皮肤成纤维细胞主要分布在静止期;增生性瘢痕成纤维细胞多数处于增殖状态;从周期分布的规律我们可以看出正常皮肤及增生性颜痕成纤维细胞的增殖能力和生长状况是有差别的,这也可以解释增生性瘢痕过度增殖的原因。P53基因是参与细胞增殖调节的重要基因之一。在凋亡调控过程中也起着重要作用,它包括野生型和突变型两种不同的存在形式^(4,5)。关于P53蛋白在调控细胞增殖机理方面的研究证实.^(6,7):P53蛋白能阻断细胞从G1进入S期,使细胞停滞在G1期,从而抑制细胞的增殖过程。当P53蛋白含量减少或基因突变后,细胞可大量进入S期,分裂增殖加剧,从而导致增殖-凋亡的失衡。ケ臼笛檠芯糠⑾,P53蛋白阳性强度正常皮肤成纤维细胞内较高,而增生性瘢痕成纤维细胞内较低。此结果与细胞周期分布结果吻合,说明在瘢痕疙瘩形成过程中,P53蛋白的调控是细胞增殖调控最重要的方式之一。P53蛋白表达的减少,导致细胞大量进入增殖期,导致细胞增殖-凋亡的失衡。ビ泄豍53蛋白在增生性瘢痕形成过程中参与增殖调控的具体模式如何?增生性瘢痕形成过程中还有哪些基因参与了它的增殖调控?是否可将P53基因导入进行增生瘢痕的基因治疗呢?研究的进一步深入必将有助于我们从一个新的角度来认识病理性瘢痕成纤维细胞增殖-凋亡失衡的机制,从而为最终揭开病理性瘢痕形成奥秘奠定理论基础。参考文献

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