反季节雏鹅大肠埃希菌病的细菌分离鉴定、毒力基因与耐药性分析

摘要：为鉴定安徽某鹅场反季节雏鹅发生早期浆膜炎的病原菌及分析其毒力基因和耐药性情况，本研究对病死雏鹅肝组织进行细菌分离培养，采用染色镜检、16SrRNA测序鉴定、毒力基因检测及药物敏感试验开展细菌相关特性鉴定。本研究分离的致病性大肠埃希菌携带多种毒力基因且具有广泛的耐药性，养殖反季节鹅应注重科学防控大肠埃希菌病。

关键词：反季节；雏鹅；大肠埃希菌；毒力基因；耐药性

鹅大肠埃希菌（Escherichia coli， E.coli）某些致病性菌株引起鹅不同类型疾病的总称，临床常表现为肠炎、败血症、浆膜炎、肿头综合征、卵黄性腹膜炎、种蛋受精率和出雏率下降等病症，主要侵害雏鹅和产蛋母鹅[1]。大肠埃希菌虽为条件性致病菌，但是幼龄动物、动物机体防御机能下降、交配和产蛋应激等因素均可使条件性致病E.coli在鹅群中发病和流行。反季节鹅养殖是利用现代技术进行舍内养殖小环境的改变，刺激种鹅在夏秋季休产期进行生产的一种生产方式[2]。然而，大肠埃希菌病多发于高温的夏秋季节，其对反季节鹅养殖威胁更大，且相关研究较少。因此，需对致病性E.coli进行分离和相关特性研究，为科学防控反季节鹅大肠埃希菌病提供切实依据。本研究对4日龄反季节鹅群分离出致病性E.coli，并鉴定了毒力基因和耐药性情况，为鹅场提供了科学防控指导。

1 材料与方法

1.1 主要材料

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）购自青岛海博生物技术有限公司，小牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，BioSmart U+ All Powerful Multiple Probe qPCR PreMix扩增试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 病鹅临床症状与剖检症状

发病鹅来源于安徽蚌埠市某鹅场饲养的反季节三花鹅，2日龄时有零星死亡，4日龄时死亡率达7%，病鹅肛周有污秽，排黄绿色稀粪。剖检显示肝脏有出血和白色坏死点，部分鹅肝脏有轻度包膜增厚，部分心包腔内有纤维素性渗出物，胰腺大量白色坏死点，脾脏有白色坏死点。

1.3 细菌分离培养与镜检

取2份鹅肝组织在含5%小牛血清的TSA培养基上划线接种，采用烛缸法于37 ℃条件下培养24 h。采用革兰氏染色法对分离菌进行染色镜检。另外，对肝组织检测鹅的8种病毒（禽流感病毒、新城疫病毒、水禽黄病毒、水禽呼肠孤病毒、鹅1型星状病毒、鹅2型星状病毒、小鹅瘟病毒和禽腺病毒）结果均为阴性。

1.4 分离菌的16S rRNA鉴定

采用煮沸法提取分离菌核酸。参考细菌16S rRNA基因通用引物，引物序列为27F：5’-AGAGTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-CTCGTGGCGTCTTCTGTCCC-3’，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。按BioSmart U+ All Powerful Multiple Probe qPCR PreMix扩增试剂盒说明配制反应体系，PCR反应总体积为50μL，上、下游引物各1μL，模板3μL。PCR反应程序为：94℃条件下预变性5min；94 ℃条件下变性30 s、55 ℃条件下退火30 s、72 ℃条件下延伸90 s，35个循环。PCR产物经凝胶电泳检测并且切胶后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，序列在NCBI网站进行BLAST分析。

1.5 分离菌的毒力基因检测

合成耶尔森（HPI）毒力岛基因irp2、fyuA，肠脱落位点（LEE）毒力岛基因eaeA，志贺毒素基因stx1、stx2，肠毒素STa，黏附素K99、FimC，共8对检测引物，预期大小分别为552、302、981、413、953、555、824、497bp。按DNA扩增试剂盒说明配制反应体系，PCR反应总体积为20μL，上、下游引物各0.5μL，模板1μL。PCR反应程序为：94 ℃条件下预变性5 min；94 ℃条件下变性30 s、50-60 ℃条件下退火30 s、72 ℃条件下延伸45 s，33个循环。PCR产物经凝胶电泳和拍照观察。

1.6 分离菌的药敏试验

对分离菌按照K-B纸片扩散法进行药敏试验，将菌液涂布于含5%小牛血清的TSA培养基，并将十二类27种药敏纸片贴于培养基表面，于37 ℃条件下培养箱培养18 h后，测量抑菌圈的直径。根据《肠杆菌属抑菌圈直径（mm）判断标准》对检测结果进行敏感性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离结果

4日龄病死鹅肝脏有出血和白色坏死点，并有轻度包膜增厚，心包腔内有白色纤维素性渗出物。用该肝脏划线接种培养基，分离菌在TSA培养基上形成表面光滑凸起、灰白色、圆形小菌落。革兰氏染色镜检显示分离菌为淡红色的革兰氏阴性短杆菌（图1）。

2.2 16S rRNA鉴定结果

分离菌的16S rRNA基因PCR扩增结果获得了预期大小的1 466bp片段（图2），将PCR扩增产物电泳切胶后送公司测序，BLAST分析显示分离菌株与E.coli的16S rRNA基因序列同源性最高，达99%以上，因此该分离菌株属于大肠埃希菌，并命名为AHBB2024株。

2.3 毒力基因检测结果

毒力基因检测结果显示，共检测到5个毒力基因（图3），分别为HPI毒力岛基因irp2、fyuA，志贺毒素基因stx2，肠毒素基因STa和黏附素基因FimC，指示该致病性大肠埃希菌携带多种毒力因子。

2.4 药敏试验结果

药敏试验结果显示，AHBB2024株致病性大肠杆菌多达21重耐药，仅对亚胺培南、庆大霉素、丁胺卡那、氯霉素、氟苯尼考、多粘菌素B共6种药物敏感，表现出较广泛的耐药性（表1）。

讨论

我国是世界上商品鹅养殖和出栏量最多的国家，但大多数鹅场存在场地简陋、养殖密度高、多种病原体污染、生物安全管理差等粗放养殖模式，这为条件性致病大肠杆菌提供了感染机会。同时，反季节鹅生长周期高温高湿，细菌性疫病高发[4]。本研究反季节鹅在4日龄时已造成纤维渗出性浆膜炎，与鸭疫里默氏杆菌病存在发病时期不同，也指示早期浆膜炎可能为种蛋出雏阶段形成早期感染和交叉感染造成，进而提示种鹅致病性大肠埃希菌病净化防控的重要性。

鹅大肠埃希菌病的诊断主要结合临床剖检和实验室分离鉴定方法，其中16S rRNA测序与序列分析已成为细菌分类和鉴定的一种有效手段[5]。本研究分离的AHBB2024菌株与大肠埃希菌的16S rRNA同源性高达99%，属于大肠埃希菌种。大肠埃希菌的致病性与其所携带的毒力因子密切相关，AHBB2024菌株携带5种毒力基因，肠毒素STa基因指示该菌株可分泌对热稳定肠毒素，志贺毒素stx2基因指示该菌株可分泌类志贺毒素，1型菌毛黏附素FimC基因参与大肠埃希菌黏附于宿主黏膜和上皮表面，HPI毒力岛irp2、fyuA基因是大肠埃希菌的摄铁因子和重要的致病因素。

使用抗生素是治疗大肠埃希菌病的有力手段，但应考虑病菌的耐药性情况。依据药敏检测结果可为科学指导养殖企业（户）用药提供依据。本研究AHBB2024菌株达到21重耐药，仅对27种药物中的6种敏感，其中对β-内酰胺类多数抗生素耐药性最强，仅第四代抗生素亚胺培南有效。殷鹤予等[6]对河北省唐秦地区蛋鸡92株致病性大肠埃希菌耐药性检测，其对林可霉素、氨苄西林、阿莫西林、复方磺胺甲噁唑、四环素耐药率较高，均在84.78%以上，本研究AHBB2024菌株对这些药物也全部耐药。崔笑博[7]对山东泰安周边部分地区分离的78株禽致病E.coli进行耐药性检测，结果表明对红霉素耐药率96.2%，对氨苄西林耐药率为92.4%，对环丙沙星耐药率为82.27%，对链霉素耐药率为74.68%，对复方新诺明耐药率为91.1%，对氟苯尼考耐药率为89.8%，对庆大霉素耐药率为72.15%，然而，本研究AHBB2024菌株却对氟苯尼考和庆大霉素敏感。因此，鹅场致病性大肠埃希菌不同菌株的耐药性不同，兽医应结合专业实验室的细菌分离和耐药性情况，同时也应鉴定是否混合感染其他病原，为反季节鹅养殖企业（户）提供科学用药指导和生物安全防控，避免无效用药及产生更多的耐药菌株。■

参考文献：

[1] 刘旭.鹅大肠埃希菌病的流行病学、临床症状、诊断及防治[J].现代畜牧科技，2020（11）： 86-87.

[2] 虞锐.反季节繁殖对浙东白鹅产蛋性能、血清生化指标及相关生殖激素的影响[D].扬州：扬州大学，2022.

[3] 陈明泽，朴春光，朴春浩，等.延边地区羊腹泻大肠埃希菌分离鉴定、毒力基因与耐药性分析[J/OL].内蒙古农业大学学报（自然科学版）：20240923.1559.002.

[4] 陈光明.种鹅反季节生产方式下蛋子瘟综合防控技术[J].江苏农业科学，2015，43（7）：223-225.

[5] 李卓君，黄晓畅，柯善林，等.基于16S rRNA基因及宏基因组测序解析藏猪肠道菌群组成特征[J].江西农业大学，2024，46（5）：1256-1265.

[6] 殷鹤予，伊雪燕，顾宇华，等.河北省唐秦地区蛋鸡致病性大肠埃希菌耐药及毒力检测[J].家禽科学，2024，46（9）：14-25.

[7] 崔笑博.禽源大肠埃希菌的分离鉴定、耐药性分析及联合药敏试验的研究[D].泰安：山东农业大学，2014.

收稿日期：2024-10-30

基金项目：安徽省教育厅重点科学研究项目（KJ2019A0800）

作者简介：刘心怡（2004—），本科，研究方向：动物疫病防控技术研发。

*通讯作者：赵磊（1982—），研究生，研究方向：动物传染病防控研究。