奶牛结核病PPD皮内变态反应精准检测技术要点探讨

摘要：奶牛结核病检测中，多采用皮内变态反应，也是目前发布的国家标准之一。本文主要分析了新疆兵团第八师石河子地区在奶牛结核病检测中存在的一些问题，希望对以后的奶牛结核病检测工作有所促进和帮助，以保证检测工作的准确性和科学性，并提出建议，以供同行参考。

关键词：奶牛结核病；PPD；皮内变态反应；精准检测；要点探讨

牛结核病是由结核分枝杆菌引起牛的一种人畜共患传染病。人的结核病有10%以上是由牛分枝杆菌引起，因此，控制牛结核病是控制人类结核病的重要途径之一，石河子地区作为新疆奶牛养殖大区，为控制和净化我区奶牛结核病，采用国内外通用的牛结核病控制策略是从“检疫－扑杀”。因此，准确检测是控制和净化牛结核病的前提。目前广泛应用的检测方法包括：提纯牛型结核菌素（PPD）、皮内变态反应试验（TST）、PPD比较皮内变态试验（SICTT）和牛 γ- 干扰素酶联免疫吸附试验（IFN-γ-ELISA）。牛结核病PPD皮内变态反应是我国国标规定的方法之一，也是目前石河子地区实施奶牛全群监测的检疫方法，在控制与净化奶牛结核病中发挥着重要作用。本文对基层奶牛结核病颈部皮内变态反应精准监测技术要点分析探讨，为今后牛结核病的精准检测提供参考。

1 PPD皮内变态反应检测应用现状

1.1 监测单位的技术能力

新疆兵团第八师石河子市动物疫病预防控制中心具体负责实施第八师石河子市牛结核病检测预警、风险评估和净化场创建等技术指导工作。

1.2 监测对象和时间

按第八师牛结核病监测方案要求，根据风险评估，按照“一病一案、一场一策”要求开展监测。

所有种牛、奶牛、肉牛养殖场对20日龄以上牛全群100%结核病检测；调运牛应来自结核病无疫区或净化场，调入前在输出地开展一次牛结核病检测，调入后应隔离45 d，经再次检测合格后，方可解除隔离。

牛结核病低风险场（成年牛净化群）：实行每半年（春、秋季节）用提纯牛型结核菌素PPD皮内变态反应试验进行一次全群监测。

牛结核病高风险场（确诊牛结核病的污染牛群）：根据牛场实际感染程度，应用风险评估方案和本场制定的牛结核病防控方案，每隔45 d～90 d应用牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验进行全群检测，检出的阳性牛及时进行扑杀并无害化处理，直至最后一次全群为阴性。

2 准备试验所需的材料试剂

2.1 结核菌素的选择和使用

试验的关键材料是结核菌素抗原。目前使用的结核菌素为提纯牛型结核菌素（PPD）。据资料报道，不同厂家的PPD其反应程度可能不同，即使同一厂家的不同批号、不同剂量的PPD也存在差异，这对结果的判定带来误差，在确定检测结果时应考虑此因素，因此在选择时应考虑其敏感性和特异性，以确保结果的一致性和准确性；此外，PPD的运输、保管和使用，应严格按照使用说明书的要求进行，使用前确认是否低温保存和有效期，应观察瓶盖无松动、瓶身完整无裂痕、冻干粉未出现潮解、干缩，用真空测定器监测是否真空。配制结核菌素要在实验室（配药室）无菌操作，PPD开瓶，必须现配现用、当日使用，隔日不能再用，溶解后有异物的均禁止使用。用过的结核菌素瓶、剩余的结核菌素液及检测完成后产生的垃圾，包括注射器、针头、口罩、防护服等应收集起来进行无害化处理。

2.2 详细记录检测信息并建立档案

记录畜主姓名、牛耳标号、年龄、繁殖状态、检测人、检测日期、初始皮厚，72 h、96 h、120 h皮厚、皮差等信息，以便通过档案能对检疫牛做出综合判定。

2.3 试剂、耗材及工具

电子数显卡尺、1 mL蓝心注射器、电动剃毛器、配液用一次性注射器、酒精药棉、0.9%生理盐水、人员防护用品（胶条防护服、手术手套、防护口罩、医用防护帽、医用防护鞋套等）、75%酒精、碘伏、回收废物生物安全箱等。

3 严格操作规程（操作方法）

标准化操作流程是保证实验质量和数据可比性的关键。检测人员应接受必要的牛结核PPD检测相关知识培训，了解牛结核病的基本知识、传播途径和防控措施，掌握检测要点、熟悉操作流程和规范操作，并能准确评估和记录结果，才能大大提高奶牛PPD试验的准确率。

3.1 接种部位确定

接种部位的选择会影响抗原的吸收速度和强度以及测量误差，直接影响到检测结果的准确性。按照国标选择在颈侧中部上三分之一处，三个月以内的犊牛，在肩胛部进行，该处测量皮厚和注射较为方便，不同的注射部位结果误差很大，

若进行比较变态反应，应选择同一侧颈中部2个点，一个在上三分之一处，一个在下三分之一处，2个点之间的距离不得少于15 cm。注射点及周围的皮肤应无明显的病变。

3.2 剃毛方法

在注射结核菌素前注射部位必须剃毛，以便于识别注射部位和消毒，做到每次测量皮皱厚度时在同一处进行。在用剃刀、刀片等剃毛时，常引起局部外伤，导致皮肤出现炎性肿胀，建议使用电动剃毛器则方便易行，无上述弊端。剃毛的直径约10 cm。

3.3 测量皮厚

检测判定中皮差以毫米计，检测试验中微小的差错都可能导致不同的结果。目前基层使用的是电子卡尺，使用较方便，但注意每一次测量完后要归零。此外，卡尺夹持皮皱的松紧程度因测量人的不同有所差异，故自始至终要由一人测量，否则造成假阳性或假阴性出现。测量时用左手食指和拇指捏起中央皱皮，卡尺卡口的按压要适中，防止过紧或过松，尽量减少误差。

3.4 注射方法及剂量

注射前消毒（75%酒精）要严格，防止注射部位的感染。且要等酒精挥发后再注射，以防止注射时酒精随针头进入体内刺激肿胀影响结果。一头牛一个注射器，注射器采用1 mL一次性使用无菌注射器（带针头）。注射时，最好用左手食指和拇指捏起中央皱皮，针头斜着45度角刺入皮肤，或者注射进针时，手腕要控制好，腕部背侧紧贴着牛颈部位，防止针尖划破皮肤。注射部位皮肤应鼓起绿豆大的小泡，表明结核菌素注射成功。如注射失败，应重新选择注射部位（对侧或者同侧15 cm以外的部位），还应做好标记和记录。注射后如出血应重新换点注射，以避免结核菌素随血液流出，或出血形成皮内（下）小血肿，影响结果判定。注射剂量严格按使用说明书的规定剂量，无论牛只大小，一律皮内注射0.1 mL，不能因为是犊牛和体重偏轻而减量，也不能因为体重较大而加量。另外，也不能稀释成低浓度或高浓度而加大或减少剂量注射。牛型PPD 0.1 mL（含2 000IU），禽型PPD 0.1 mL（含2 500IU）。抽取PPD时，应注意排除注射器内的气泡，以减少

误差。

4 正确掌握判断标准

按照操作规程72小时观察结果并测量皮厚，个别牛出现迟发型变态反应，可疑牛和阴性牛在96 h和120 h必须再分别观察一次。通过观察注射部位是否有炎性反应、触摸肿块是否有结节和皮厚差综合判定结果。在生产实际中，一些操作人员容易凭借“经验”判定结果，认为只要接种部位没有“鼓包”就是正常的，其实不然，有些皮内变态反应会形成明显的隆起，有些变态反应则是扩散性的，表面看不出异常反应，但实际则出现增厚反应，因此必须借助仪器判定。在此期间，被检测牛术部也可能因为机械或蚊虫（尤其在夏、秋季节）叮咬而引起肿胀，在观察过程中一定要分清。注射部位前后出现明显的炎性反应，且皮皱厚差值大于或等于4.0 mm时判为阳性；无明显炎性反应，且皮厚差值为2.0 mm-4.0 mm时判为可疑；无明显炎性反应，皮厚差值小于或等于2.0 mm时判为阴性[1]。

5 引起非特异性反应的因素

根据本地区的试验结果，由禽型结核分枝杆菌和副结核及其他分枝杆菌引起的假阳性较低，而奶牛生理性的（发情期、妊娠后期，其敏感性增高）、饲料配合不平衡，日粮中蛋白质饲料过高，或过度饮食酸性饲料、临床上使用激素、药物制剂及接种某些疫苗、机体患有某些传染病或寄生虫病以及人为操作不当等原因常常可引起假变态反应。因此，在奶牛结核检测中，对上述因素必须综合考虑，减少由非特异性因素引起的假变态反应。

6 讨论与分析

在奶牛结核病防控和净化中，采用国标规定的提纯牛型结核菌素（PPD）颈部皮内变态反应取得了明显的成效，该方法的优点是灵敏度高，便于现场操作作业，价格低廉，容易进行判定，缺点是操作费时烦琐，结果判定主观性大、存在非特异性高的缺点等，因此造成结果的判定存在一定的误差。其精准度的提升对于早期诊断和有效防控至关重要。

研究表明，按农业农村部颁发的《牛结核病提纯结核菌素变态反应操作规程》，用提纯的牛型结核菌素对奶牛进行皮内注射变态反应检测奶牛结核病时，检出准确率可达到95%～98％。但如操作不当或不规范，检出准确率则会大打折扣[2]。

按照《动物结核病诊断技术（GB/T18645-2020）》，20日龄以上的奶牛均应进行监测。但是在实际工作中，60日龄以下的犊牛在实际操作中往往不能100%检测，存在幼龄犊牛漏检现象。据资料报道，犊牛年龄越小患病率越高，1个月龄的犊牛患病率占2.46%，3个月龄患病率占0.88%，而6个月龄的仅占0.41%。

在实际工作中，我们观察到，一些牛型结核菌素变态反应阳性牛，多数营养良好，体壮，临床无明显牛结核症状或者临床症状不典型，病理学观察时只从眼观变化很难全部看到病变，所以单凭肉眼看不到结核病变的牛， 不能盲断为假阳性牛。可能原因：牛结核病感染初期或轻度感染时，还未发病，可能不出现临床症状；此外，由于皮内结核菌素试验能够对结核病提前做出诊断，大部分感染牛在临床症状出现前已被淘汰，因而牛结核病的临床症状很少遇到，通常只有少部分发病后期的牛可观察到一些与结核病有关的症状。这些症状随着体内结节的分布而变化，除少数病例外，病程较慢，在多数情况下，甚至在晚期阶段，仍无特征性症状。

提纯牛型结核菌素（PPD）颈部皮内变态反应试验可疑牛的复检时间问题《动物结核病诊断技术（GB/T18645-2020）》中6.3.1c）规定，“对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批PPD同一剂量进行第二次皮内注射，再经72h观察反应结果。”据王忠山等报道，用牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应诊断奶牛结核病，对试验检出的阳性牛和可疑牛立即用该方法进行复检试验检测，多数牛（87.2%）的变态反应会受到抑制，弱化前次实验，导致前后检测结果不一致。由于迟发型变态反应出现滞后效应，不能在一段时间内重复

进行[3]。

关于牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验检出的阳性牛的处理。根据笔者2019—2020年来对新疆石河子地区4家规模牛场通过牛型提纯结核菌素皮内变态反应检出的475头阳性牛进行比较，结果表明：牛型结核阳性457头，符合率在93.18 %-100 %之间，平均96.21 %；禽型结核病的11头，阳性率在0%～3.57%，平均2.32%。根据以上我们所做的试验及本地区奶牛场的实际情况，为达到控制和净化的目的，建议本地区通过牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验检出的阳性牛不再复检，直接扑杀或无害化

处理[4]。

严格试验操作规范，减少人为因素的误判。牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验操作简单，但需要注意的细节很多，技术人员及相关人员往往因为不规范操作而影响结果的判定，造成不必要的损失。因此，应制定程序化的操作步骤，对技术人员及相关人员进行培训，要求每人熟练每个环节的操作要领，并对人员合理分工，使检测工作能够有条不紊地开展。此外，要做好检测人员的卫生防护，确保自身安全。

未来的研究应聚焦在以下几个方向：一是开发新型的、特异性更强的抗原，以提高PPD检测的性能；二是探索更精准的接种部位，减少测量误差和非特异性反应；三是建立更为完善的判断标准，结合多种检测方法，提高诊断的综合准确率；四是加强实验室标准化操作的推广，确保实验的可复制性和结果的可靠性。■

参考文献：

[1] 全国动物卫生标准化技术委员会.动物结核病诊断技术：GB/T18645-2020[S].北京：中国标准出版社，2020.

[2] 姚智深.如何提高奶牛PPD试验的准确性[J].中国奶牛，2014（6）：58-60.

[3] 王忠山，邓红江，刘向鹏，等.短期内进行牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应复检试验的结果变化观察[J].中国兽医杂志，2013，49（06）：41-43.

[4] 王宏伟，李新萍，李劼，等.新疆石河子地区牛结核病检测方法的比较研究[J].中国奶牛，2020（07）：33-35.

收稿日期：2024-11-18

基金项目：兵团科技计划（2023AB009-02）

作者简介：王宏伟（1968—），男，本科，高级兽医师。研究方向：动物疫病防控。

*通讯作者：窦立静（1975—），女，本科，高级兽医师。研究方向：动物疫病防控。