小鼠股动脉结扎诱导下肢缺血后骨质疏松症的动物模型构建与评价

摘要：本研究旨在建立与评价小鼠股动脉结扎诱导下肢缺血后骨质疏松症的动物模型。7周龄C57BL/6J雄性小鼠按每组10只随机分为造模组和对照组。在股动脉主干近端进行双重结扎小鼠作为造模组；仅切开皮肤小鼠作为对照组。术后，分别比较小鼠下肢血流、小鼠行为学和小鼠骨量的变化。本研究结果表明成功构建小鼠股动脉结扎诱导下肢缺血后骨质疏松症模型，该模型骨丢失较明显。

关键词：股动脉结扎；缺血；骨质疏松症；动物模型

意外事故所致骨损伤逐年上升，由此而开展的骨折、截骨术也越来越普遍。各种原因引起的血管系统损伤难以恢复或不完全恢复。血管功能的异常破坏，引起血流供应减少导致骨骼中伤口及其周围区域内血氧供给长期降低（氧分压范围为0至10 mmHg）[1]。随着全球人口老龄化的加剧，创伤性外伤和骨折等事件发生率显著增加。长期活动受限使得下肢局部组织血液供应不足，气体交换失衡，最终导致骨组织局部缺氧。血管附近的成骨细胞和破骨细胞相互密切作用以保持骨量和结构[2]。在缺氧条件下，破骨细胞会启动一系列分子和生理上的适应性调整，以维持其生存和功能[3]。因此，靶向低氧环境下的破骨细胞生成研究可能是血管—骨偶联的潜在方向。

目前，探究血供异常组织缺血缺氧导致骨质疏松症的动物模型尚无明确报道。为探究缺血缺氧后对局部组织骨量的影响，我们拟建立小鼠股动脉结扎诱导下肢缺血后骨质疏松症模型进行研究，对其活动能力、下肢骨量进行统计分析以评价本实验模型的成功建立。

1 材料和方法

1.1 时间及地点

实验于2024年4～6月在广西医科大学动物实验中心完成。

1.2 材料

一 实验动物 C57BL/6J小鼠20只，SPF级，7周龄，雄性，体重18±2 g。随机分组，5只/笼，12 h的光照与12 h的黑暗交替周期，自由采食饮水。实验操作严格遵循实验动物伦理标准，并经广西医科大学实验动物管理委员会、实验动物伦理委员会批准。实验动物购自广西医科大学动物实验中心。实验动物生产许可证号为 SYXK（桂）2020-0004。实验伦理编号（NO.202403013）。

二 主要仪器设备 Micro-CT skyscan1170（美国Bruker公司）；激光散斑血流成像仪（中国深圳瑞沃德公司）；显微手术器械（重庆奥特光学仪器有限公司）。

1.3 实验方法

一 实验分组：20只小鼠适应性喂养7 d后按照随机数字表法分为左股动脉结扎组和对照组，每组10只。

二 模型制备：所有实验小鼠在造模前12 h禁食、不禁水。

第一，左股动脉结扎组：腹腔注射1.25% 阿佛丁（0.2 mL/10 g），待小鼠进入麻醉状态后，小鼠左侧下肢剃毛，仰卧体位固定于手术台，碘伏酒精消毒待开创皮肤，纵向于大腿内侧腹股沟部做一长约1.0 cm切口，暴露内侧肌肉，钝性分离股动脉，自股动脉主干近端起进行双重结扎，后将两个结扎点中间血管离断。最后，使用5-0缝合线缝合筋膜层和皮肤层。小鼠右侧下肢则切口后缝合。

第二，对照组：小鼠双侧下肢切口后缝合。

三 激光散斑血流成像仪观察术后小鼠下肢血流量变化

术后第0、7、14天对造模组小鼠进行下肢血流检测，造模组小鼠进行麻醉，双下肢剃毛，碘伏酒精消毒，使用激光散斑血流成像仪检测双侧下肢血流信号，扫描记录5 s内双侧下肢血流灌注（perfusion unite，PU）值。比较造模组小鼠左侧与右侧下肢的PU值。

四 术后小鼠行为学观察与评估

待小鼠适应环境后，每次将小鼠取出置于另一空笼中，手部轻敲鼠笼的一侧产生声响与震动，观察小鼠活动能力和状态，对两组小鼠的反应能力及活动范围进行综合评估。观察记录人员按照表1的准则进行小鼠活动能力简易标准化评定。以下计分以2人计分的平均值作为分析数据。

五 Micro-CT扫描观察小鼠术后胫骨骨量变化

两组小鼠在术后第28天时，用1.25% 阿佛丁（0.2mL/10克）腹腔注射麻醉，采取颈椎脱臼法处死。使用CT仪（Bruker Skyscan）对小鼠胫骨进行扫描，扫描参数为：旋转步长0.4，电压50 kV，像素尺寸9μm，0.5mm铝制滤波器，源电流500μA。扫描完成后通过利用CTAn和CTVoL软件对扫描数据进行三维建模分析。选取胫骨远端生长板上方1～1.5mm骨小梁作为感兴趣区域进行分析。我们对骨小梁体积/组织体积（Trabecular Volume/Tissue Volume， BV/TV），骨小梁厚度（Trabecular thickness， Tb.Th），骨小梁数量（Trabecular Number， Tb.N）和骨小梁分离度（Trabecular Separation， Tb.Sp）进行了计算。

六 石蜡切片HE染色观察两组小鼠骨量变化

处死小鼠后，我们制作了小鼠的石蜡切片，染色前先进行脱蜡。将切片用蜡笔画圈后加入蒸馏水水合切片。吸出蒸馏水加入苏木素染液5 min，蒸馏水漂洗切片，放入分化液分化30 s，漂洗切片。放入伊红Y染色30 s。染色完成后脱水封片。显微镜获取图片。

1.4 统计学处理

使用Prism Software 9.5 对实验数据进行统计分析及量化绘图。统计方法选用独立样本t检验。所有实验数据均以平均值±标准差表示。P值为＜0.05被认为是有统计学上的显著差异。

2 结果

2.1 实验动物数量分析

参与动物实验的20只小鼠均未死亡，全部进入实验数据分析。

2.2 股动脉结扎诱导下肢缺血（FAL）小鼠模型的成功构建

研究期间，我们运用激光散斑血流成像仪检测左股动脉结扎组小鼠双侧下肢血流变化情况，术后，造模组小鼠左侧结扎下肢血流信号明显弱于右侧下肢血流信号，左侧下肢血管离断明显（图1A）；左侧下肢PU值（图1B）显著低于右侧下肢PU值。同样地，术后第7、14天左侧下肢PU值（图1C、D）明显低于右侧下肢PU值。基于以上实验分析，我们认为成功构建了FAL小鼠模型。

A：激光多普勒成像检测造模组小鼠双下肢血流变化情况；B-D：造模组小鼠第0、7、14天下肢血流灌注量统计。

2.3 术后两组小鼠行为学变化

造模组小鼠术后行为学表现为步态紊乱、跛行、舔舐左侧下肢及手术切口、左侧下肢出现悬挂、活动减少等，且术后的活动能力均随时间延长而逐渐增强。FAL组小鼠的步态与活动能力于术后第11天基本恢复正常水平，于术后第14天完全恢复对照组小鼠活动水平（图2）。

2.4 FAL小鼠发生骨丢失

为了评估FAL小鼠骨微结构的变化，我们使用Micro-CT扫描小鼠胫骨并分析了胫骨远端，结果发现FAL小鼠与对照组相比出现明显的骨丢失和骨微结构的改变；如（图3A）所示。骨参数数据的统计学定量分析结果与Micro-CT结果一致，与对照组相比，FAL组BV/TV（图3B），Tb.N（图3C）出现明显下降，Tb.Th（图3D）没有显著的变化趋势，Tb.Sp（图3E）明显升高。这些结果都表明FAL小鼠发生了骨丢失。

A：两组小鼠左侧胫骨Micro-CT的代表性图像；B-D：两组小鼠骨微参数BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp定量分析（n=4）。

2.5 FAL小鼠发生骨丢失

同样地对两组小鼠骨组织进行了HE染色，与Micro-CT结果一致，造模组小鼠骨量明显下降（图4）。

A：两组小鼠左侧胫骨HE染色的代表性图片（n=4 ）。

结语

血液供应不足导致骨组织细胞处于缺氧环境当中，缺氧是骨质疏松症和类风湿性关节炎这些疾病的常见特征。此外，已知与缺氧相关的许多因素，包括能量代谢的变化、酸碱平衡等都会影响骨代谢。缺氧导致线粒体能量产生不足和活性氧过多，从而损害线粒体功能，导致骨稳态被破坏[4]。许多证据表明，缺氧诱导途径在介导骨代谢变化中起着不可或缺的作用。基于相关研究报道，我们猜想下肢血管损伤导致的局部组织缺血缺氧可能会导致骨质疏松症。

血管的再生是骨再生和骨代谢的一个研究热点，但缺乏一种能有效模拟股动脉损伤后缺血所致骨质疏松症的标准化实验动物模型[5]。目前，动脉结扎缺血模型常被用于心血管疾病研究，但对于血管损伤缺血导致骨质疏松症的研究鲜有报道[6]。对于下肢由于缺血缺氧导致骨丢失的研究中，尚没有适宜的造模方法。因此，本研究致力于建立一个稳定模拟下肢动脉血流受阻导致局部缺血缺氧的动物模型。常见的动物如兔、大鼠、小鼠、犬等常作为研究下肢缺血疾病的动物模型[7]。考虑到小鼠具有来源方便、成本低、饲养周期短等优势，因此以小鼠为下肢缺血诱导骨质疏松症的动物模型更占据优势[8]。本实验选取C57BL/6J小鼠作为研究对象，通过股动脉结扎法造成血供异常、局部骨组织细胞缺血缺氧，成功建立了小鼠股动脉结扎骨质疏松症模型。

在本实验，我们通过血流观测分析在造模后小鼠的第0、7、14 d三个时间点，发现左侧下肢的血流灌注量显著低于右侧下肢，这提示血管结扎成功。此外，行为学观察与评估显示，造模后小鼠的活动能力有所下降，但在14天后逐渐恢复至正常水平。通过影像学检查和石蜡切片染色分析，我们观察到造模组小鼠出现了明显的骨量丢失，这一发现证实了我们的缺血后骨质疏松症模型构建成功。这些结果表明，该模型能够有效地模拟缺血缺氧骨质疏松症的病理过程，为研究其发病机制及评估治疗效果提供了可靠的实验基础。这或许能为进一步研究血管损伤缺血导致骨质疏松症的临床治疗提供新见解、新思路。■

参考文献：

[1] KAUVAR D S，STAUDT A M，ARTHURS Z M，et al.Early Fasciotomy and Limb Salvage and Complications in Military Lower Extremity Vascular Injury [J].The Journal of surgical research，2021，260： 409-18.

[2] 胡劲涛，阮立奇，钱剑胜，等.补肾活血方对去势骨质疏松小鼠骨-血管形成偶联调节作用的实验研究[J].中国中医药科技，2024，31（06）：971-975.

[3] 范晓霞，姚勇利，蔡春梅，等.缺氧在骨质疏松与骨稳态中作用的研究进展[J].生理科学进展，2023，54（05）：403-408.

[4] 李宏元，杨柳，靳宪辉.缺氧诱导因子与骨稳态失衡类疾病的相关性[J].中国组织工程研究，2022，26（33）：5393-5399.

[5] 钱浩，肖志彬，贾鑫，等.文冠木提取物通过抑制血管新生和骨吸收缓解类风湿性关节炎[J].中药药理与临床，2024，11（12）：1-15.

[6] 肖家旺，朱鲜阳，张端珍，等.心血管外科动脉导管未闭外科结扎术后残余分流介入治疗[J].心肺血管病杂志，2021，40（07）：699-702.

[7] 王杰，张世勇，王雪，等.比格犬下肢缺血模型的建立[J].郑州大学学报（医学版），2020，55（06）：822-826.

[8] 丁云，隋钧皓，侯宜锦，等.小鼠股骨骨折合并坐骨神经损伤的标准化动物模型构建与评价[J].海军军医大学学报，2023，44（02）：214-221.

收稿日期：24-11-18

基金资助：国家自然科学基金项目（82460434），项目负责人：刘倩

作者简介：王莉（2000—），女，研究生，研究方向：中草药单体防治骨质疏松症疾病的研究。

通讯作者：刘倩。