基层兽医实验室布鲁氏菌病虎红平板凝集与试管凝集试验误差分析

摘要：动物布鲁氏菌病在基层实验室一般通过血清学检测，即虎红平板凝集和试管凝集进行确诊，本文对两种检测原理及影响因素进行了全面的分析和总结，以期提高检测正确率从而提高布病检疫净化的效率，减少养殖户经济损失。

关键词：布鲁氏疾病、试管凝集、虎红平板凝集、试验误差分析

布鲁氏菌病（Brucellosis），简称布病，是由布鲁氏菌侵入机体后，引起变态反应性的人兽共患的全身性传染病。《中华人民共和国动物防疫法》将其规定为乙类传染病，农业农村部列为二类动物疫病病种。

1 流行病学调查及基层布病防控现状

牛、羊、猪是引起疾病的主要病原菌，其中牛、羊传播率较高。易感动物主要通过消化道、呼吸道、破溃皮肤或结膜等黏膜组织接触到布鲁氏菌，由于其具有易感性而造成感染。直接接触主要发生在混牧、圈舍饲养、集贸市场交易和运输过程中与患病动物接触而造成感染，人也可通过接触病畜脏器、血液、皮毛从而感染布病；间接接触主要是被污染的圈舍、场地、水源、草料、饲养人员以及气溶胶等多种途径而感染布病。在流行病学调查中发现，除部分牲畜妊娠期出现流产、胎衣不下、乳房炎、睾丸炎、附睾炎等明显症状，大多家畜成隐性发病，感染后通常不会表现出明显的临床症状，这也给布病防控净化带来了难度。养殖户在养殖过程中不易察觉，感染此病后造成患者低热、多汗、肌肉和关节酸痛、乏力或肝、脾、淋巴等组织不同程度的损伤，临床症状多变且无特异性。因此，兽医实验室对家畜布病的确诊、净化至关重要。

近年来，为促进现代农业提档升级，活畜禽调运和市场交易日趋频繁，畜牧养殖业发展成为农民增收致富的“稳定器”，但布病在畜群和人类之间的感染率逐年程上升趋势，严重威胁着畜牧业的发展和公共卫生事业，引起各级政府、兽医行业管理部门和动物防疫机构的高度重视，甘肃省将其列为重点监测病种，采取“免疫接种为主、检测净化为辅”的方式，在免疫全覆盖的基础上，有针对性地对调引牛羊、引起人感染布病的重点区域和高流产率畜群以及其他可疑情况开展全群跟踪监测，以及早发现并剔除阳性个体。因此，基层兽医实验室应坚持科技引领，加强防控能力建设，减少实验误差，提升检测及鉴别诊断技术。

2 检测确诊方法

目前，基层实验室依照《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2018）进行操作与判定：虎红平板凝集试验进行初步筛选，疑似阳性的样品再使用试管凝集进行复检，试管凝集试验为阳性的，判定为感染动物[1]。虎红平板，价廉、快速简便，适用于大批量初筛，但由于抗原特异性、温度、试剂灵敏度等诸多因素的影响，出现假阳性较多，需进行试管凝集复检，以确保判定准确，减少养殖户经济损失。

3 实验原理

3.1 虎红平板试验原理（RBT）

所用抗原含有苯酚的酸性（PH3.6-3.9）粉色抗原，细菌抗原与相应的抗体（血清）混合后，在电解质参与下，抗原和抗体凝集成肉眼可见的凝集小块。血清与虎红平板凝集抗原等量（30 μL）混合后，4 min内若出现肉眼可见的凝集颗粒，判定为阳性（最低检出限为22.22 IU/mL）。

3.2 试管凝集试验原理（SAT）

试管凝集抗原与抗体（血清）混合，在电介质作用和37 ℃温箱条件下作用24 h，抗原抗体形成复合物沉于试管底部，混合液清亮程度会发生变化，通过观察混合液清亮程度，可判定是否存在布鲁氏菌抗体。牛、骆驼、马血清稀释倍数为1：25至1：100，羊、猪血清稀释倍数为1：50至1：400，当第二管试剂，即1：50（羊、猪1：100）出现“++”以上凝集时，该样品判为阳性[2]（最低检出限羊/猪为25 IU/mL，牛/骆驼/马为50 IU/mL）。

4 共性影响因素分析

4.1 血清

畜禽采血分离血清是疫病监测、检测、诊断和评估免疫效果的一项前提性工作，血清质量直接影响检测结果。

4.2 采血管影响

采血管分为普通采血管与含肝素钠抗凝剂采血管。普通采血管中不含抗凝剂，血液样品采集凝血后离心，产生的上清液则为血清，而含有抗凝剂的采血管离心后，上清液则是血浆，前者在凝血的过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，血清中无纤维蛋白，后者则与之相反。使用血浆试验，纤维蛋白会与抗原结合，出现假阳性[3]。因此，采集样品过程中应使用普通采血管，以避免出现假阳性。

4.3 血清质量

进行试验的血清样本应当无腐败气味、无溶血、透明清亮，样品新鲜。血清分离分为自然析出法与离心机分离法，自然析出法获得的血清质量更好，但要保证静置时间大于1小时，血液样本放置于20～37 ℃环境中，使纤维蛋白原收缩凝集，此时血液标本阳性率趋于稳定，降低假阳性率。因此，血液采集后应在凝血反应被激活、血液凝固后再移动样品或者进行离心，降低纤维蛋白原与虎红抗原、试管凝集抗原产生的非特异性凝集反应。

5 个性影响因素分析

5.1 虎红平板试验影响

第一，抗原灵敏度。诊断抗原用布病阳性参考血清国家标准品（1 000 IU/mL）标化，与0.5%苯酚生理盐水1/45（22.22 IU/mL）稀释的国家标准阳性样品出现清晰地阳性反应，与1/55（18.18 IU/mL）稀释的国家标准阳性血清不反应[4]。不同厂家的试剂对同一批样品的检测会产生差异，因此，抗原的质量对试验的准确性有一定的影响，抗原灵敏度并不是越高越好，如果假阳性率过高，不仅会加大工作量，还会造成不必要的经济损失。

第二，试剂样品温度。在2～8 ℃条件下保存，保质期为12个月，实验室应按照规定的温度储存虎红平板凝集试验抗原，实验室需要将抗原和血清恢复室温（22±4 ℃）后使用，从冰箱中取出后立即试验，则会导致实验的敏感性降低。

第三，试验操作。采用虎红平板凝集试验反应板进行检测，减少试验过程中反应板的影响。实验前，应采用阴性对照样本检查虎红试剂是否存在自凝现象，试验过程中加入抗原和血清时应先分离，样品加完后再用牙签或木棍迅速混合均匀，涂布直径为2 cm，避免反应时间过长或涂布直径过大导致的假阳性。在自然光照下轻晃4 min判定结果，若4 min内为阴性，而4min后观察为阳性，则最终判定为阴性，说明检测样本抗体浓度未达到最低检

出限。

5.2 试管凝集试验影响因素分析

第一，器皿及湿度。基层兽医实验室布病试管凝集试验现多采用一次性真空采血管，这样不仅能够减少实验步骤，还能够降低试管洁净度带来的试验误差。为确保在温箱放置过程中因水分缺失造成的实验误差，产生气溶胶，造成实验室污染，反应过程中最好加盖。

第二，5%石碳酸生理盐水。抗原稀释液与被检血清稀释使用5%石碳酸生理盐水（羊使用5%石碳酸10%NaCL溶液），能够抑制血清中IgM类抗体的凝集活性，检测IgG类抗体，提高反应的特异性。同时，低浓度石碳酸有一定的抑菌作用，提高实验的准确性。

第三，前带现象的影响。试管凝集检测过程中会出现稀释度低的血清在管内不凝集，而稀释度高的血清在管内出现凝集的现象，这叫做前带现象。胶体粒子学说，是由于稀释度低的血清中所含胶体粒子多，即抗体过剩，影响免疫复合物的形成，稀释度高的所含胶体粒子少，所以出现了凝集，导致阴性或假阳性的结果。此时，需多采用几个稀释度进行复检或者采用其他方法复检[5]。

第四，试验操作。试管凝集试验加样要注意将血清加到管底，稀释吹吸次数尽量保持一致，同时，要避免气溶胶产生（气泡破裂等），加入抗原后震荡混匀，比浊管制作与试验同时进行，判定结果时应选择自然光线。操作过程中需要注意的细节，在实验室人员操作前要进行统一的培训，减少人为操作过程中引起的实验误差，提高检测结果的准确性。

6 检测结果存在差异因素

虎红平板凝集试验检出阳性样品，试管复检为阳性，则判定为布鲁氏菌病阳性患病动物；试管复检为阴性，判为阴性的样品，可能是因为血浆引起的非特异性反应或抗体浓度在22.22-50IU/mL之间，造成不凝集现象。虎红平板为阴性，试管为阳性的样品，原因可能是小肠耶尔森等早期感染的IgM交叉反应或布鲁氏菌病早期感染的IgM类抗体反应，引起凝集现象。

结语

虎红平板与试管凝集试验作为基层兽医实验室布病确诊试验，其准确性直接关系到养殖户的经济利益。因此，实验室工作的专业技术人员在布病检测前应进行岗前培训，开展内部比对，确保在操作过程中保持一致，减少人为实验误差，实验过程中注意血清样品质量、温度、稀释液、前带现象等因素影响，以防止出现假阳性结果。在检测前应当加强抗原与样品的检查，确保样品与实验要求相符，从而提高检测准确率。■

参考文献：

[1] 全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC 181）.动物布鲁氏菌病诊断技术.GB/T 18646-2018[S].2018-02-06：1.

[2] 卢旺银，王子坚.动物布鲁氏菌病防治[M].兰州：兰州大学出版社，2023，7：119-120.

[3] 张智鹏.抗凝剂对动物布鲁菌病虎红平板凝集试验的影响[J].动物医学进展，2017，38（11）： 132-136.

[4] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[M].北京：中国农业出版社，2016：122.

[5] 张莉，王占辉，张永梅，等.影响布鲁氏菌病抗体检测的因素分析[J].医学动物防制，2015，31（12）：1416+1433-1434.

收稿日期：2024-12-26

作者简介：谭镇阳（1995—），女，兽医师。研究方向：动物防疫、兽医实验室检测工作。