一例鹦鹉肺炎克雷伯菌感染的诊断报告

摘 要：山东省某养殖场饲养的12日龄鹦鹉出现呼吸困难、鼻腔内充满干酪样分泌物等症状，采集死亡鹦鹉的鼻腔内分泌物和肺脏组织分离细菌，通过生化试验、16S rDNA测序和系统进化树分析，初步证实该病由肺炎克雷伯菌肺炎亚种所致。药物敏感性试验结果显示，该分离菌对大部分药物耐受，仅对氟苯尼考、氧氟沙星等药物高度敏感，对多粘菌素B、阿米卡星等药物中度敏感。本研究为鹦鹉肺炎克雷伯菌感染的临床诊治提供了理论依据和参考。

关键词：鹦鹉；肺炎克雷伯菌；分离鉴定；药敏试验

中图分类号：S858.39 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2025）02-0037-06

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia）是一种引起多种动物和人类肺炎的革兰氏阴性条件性病原菌，属于肠杆菌科，克雷伯菌属[1]。肺炎克雷伯氏菌分为肺炎、臭鼻和鼻硬结3个亚种，其中肺炎亚种广泛存在于人和动物的上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时便会诱发疾病[2]。已有报道鹦鹉感染肺炎克雷伯氏菌后临床上表现出伸颈、呼吸困难、鼻腔堵塞、肺炎等病症，严重影响了鹦鹉养殖业的发展[3]。2023年山东省某养殖场饲养的12日龄鹦鹉出现呼吸困难、鼻腔内充满干酪样分泌物等症状，剖检发现肺炎、肝脏变化不明显。经细菌分离培养、形态学观察、生化试验、基因测序和系统进化树鉴定分离菌为肺炎克雷伯菌肺炎亚种感染，经药敏试验筛选出敏感药物进行治疗，该鹦鹉群疫情很快得到控制，现总结如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源

采集山东省某养殖场12日龄发病鹦鹉的鼻腔粘液和肺组织。

1.2 主要试剂

pMD-18T克隆载体，购自TaKaRa公司；PCR扩增试剂盒，均购自Axygen公司；细菌微量生化管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；药敏纸片，购自北京艾博利德商贸有限公司；LB培养基、麦康凯培养基及其他试剂，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离 无菌采集发病鹦鹉的鼻腔组织粘液在LB固体培养基上划线培养，置37 ℃恒温培养箱培养18～24 h；挑取单菌落在麦康凯培养平板鉴别培养，观察菌落生长情况；革兰氏染色后镜检观察。

1.3.2 生化试验 挑取分离菌（标记为：KP-parrot）单个菌落，参照《伯杰细菌鉴定手册》[4]，按照生化管说明书进行生化试验。

1.3.3 16S rDNA序列测定及分析 挑取分离菌KP-parrot的单菌落悬浮于50 μL双蒸水作为模板，使用16s rDNA通用引物：上游引物为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物为5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，按照以下比例配制反应体系：模板1 μL，上下游引物 （ 20 pmol/μL） 各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，补充去离子水至25 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，

72 ℃ 1 min，共进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。将阳性PCR产物送生工生物工程 （ 上海） 股份有限公司测序。

将序列与GenBank中登录的产酸克雷伯菌株、产气克雷伯菌、变栖克雷伯菌、肺炎克雷伯菌肺炎亚种、肺炎克雷伯菌臭鼻亚种、肺炎克雷伯菌鼻硬结亚种等肺炎克雷伯菌核苷酸序列对比，见表1；使用MEGA 7.0制作系统发育树。

收稿日期：2024-08-23

基金项目：山东省重点研发计划（2022CXGC010606，2022CXPT010-04）；山东省家禽产业技术体系首席专家项目（SDAIT-11-01）；

2024年山东省农业重大技术协同推广计划（SDNYXTTG-2024-09）

第一作者：黄涛（2000—），硕士研究生，兽医专业，E-mail：erbercom@163.com

通信作者：马秀丽（1978—），研究员，主要从事禽病诊断与防治技术研究，E-mail：maxiuli1978@163.com

1.3.4 药物敏感试验 按照WHO推荐的琼脂纸片扩散法（K-B）对分离菌进行药敏试验，结果按照NCCLS标准做出判定。所用的检测药物有氟苯尼考、强力霉素、四环素、恩诺沙星、氧氟沙星、庆大霉素、多粘菌素B、头孢噻肟、阿莫西林、氨苄西林、卡那霉素、阿米卡星、链霉素、红霉素、林可霉素、复方新诺明、恩诺沙星等。根据药敏结果选择敏感药物治疗。

2 结果

2.1 细菌分离与培养结果

患病鹦鹉的鼻腔液在LB固体培养基上划线，37 ℃培养24 h后可见圆形、隆起、灰白色、光滑湿润的菌落。挑取单菌落在麦康凯培养平板上划线，可见粉色、大而隆起、光滑湿润菌落，48 h后相邻菌落融合成脓汁样；革兰氏染色后镜检为革兰氏阴性杆菌，单个、成对或短链状排列的短小杆状，菌体小，约（0.5～0.8）μm×（1.5 ～2.0）μm，见图1。

2.2 生化试验结果

生化试验结果见表2。分离菌KP-parrot能利用麦芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、尿素，判为阳性；不能利用枸橼酸盐，判为阴性；不产生硫化氢，判为阴性。

2.3 16S rDNA测序分析

通过PCR扩增出的目的片段大小约1 200 bp，见图2；测序结果经NCBI网站BLAST比对，与肺炎克雷伯菌的核苷酸同源性高达99%。

利用Mega7.0软件对分离菌KP parrot及其它参考序列进行系统发育树分析，结果显示KP parrot菌株与肺炎克雷伯菌肺炎亚种AAM7株（GenBank：MK512007）分布在同一分支上，亲缘关系最为接近，见图3。结合细菌特征及生化试验结果，初步鉴定该菌为肺炎克雷伯菌肺炎亚种（subsp. pneumoniae）。

2.4 药敏试验结果

药敏结果显示分离菌对于氟苯尼考、氧氟沙星高度敏感；对多粘菌素B、阿米卡星表现出中度敏感；对强力霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星、头孢噻肟、阿莫西林、氨苄西林、红霉素、链霉素、林可霉素、复方新诺明等均表现为耐药，结果见表3。

根据药敏试验结果选择敏感药物氟苯尼考溶液治疗，按照说明书推荐剂量连续用药5 d，发病鹦鹉的呼吸道症状缓解，同时配合做好环境消毒，有效控制了该病。

3 讨论

肺炎克雷伯菌在自然界的分布极为广泛，但由于其作为一种条件致病性病原菌，因此未受到业内人士的广泛关注。近年来，随着养殖业的迅速发展，集约化养殖规模逐渐增大，各种动物疫病种类也层出不穷。一旦动物机体免疫能力下降，肺炎克雷伯菌这类条件性致病菌便有机可乘。研究发现，由于抗生素的大量使用导致肺炎克雷伯菌的耐药性呈现逐渐增强的趋势[5-6]，因肺炎克雷伯菌感染动物的病例屡见不鲜，如禽类尤其是鹦鹉感染后会流鼻涕、眼周水肿、鼻孔内出现干酪样堵塞物、呼吸困难以及肝脏点状坏死、心脏及皮下存在黄色的胶冻样渗出物[7]；羊感染后肺部严重充血，肝脾淤血肿大[8]；鼠感染后心肌纤维肿胀、脾小梁水肿、肺部毛细血管扩张[9]，严重阻碍了养殖业的发展。

本试验从鹦鹉鼻腔粘液中分离出疑似病原菌，对分离菌的形态、生化特性进行验证，发现该菌的生化鉴定结果符合肺炎克雷伯菌的生化特性，与左伟等[10]的试验结果相一致。通过16S rDNA测序和系统发育树分析，进一步确定分离株为肺炎克雷伯菌肺炎亚种。通过药敏试验结果发现，分离株仅对部分四环素类、喹诺酮类高度敏感，对部分喹诺酮类、氨基糖苷类和多肽类药物中度敏感，对大部分药物不敏感，其药敏结果与符德佳等[11]的试验结果存在一定的差异，表明不同区域不同动物所分离的肺炎克雷伯菌对药物的敏感性也不尽相同，实际生产中最好通过药敏试验选择敏感药物，以减少抗生素的滥用，避免耐药细菌的产生。

通过后续的跟踪观察，养殖户使用氟苯尼考溶液治疗后，病情得到了很好的控制。本研究对鹦鹉肺炎克雷伯菌的有效防控具有一定的借鉴意义。

参考文献：

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[10]左伟，武琦，张千，等.藏猪源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].黑龙江畜牧兽医，2022（9）：72-79+141.

[11]符德佳，康桦华，曾宪军，等.鸡场饮水中肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐药性研究[J].广东农业科学，2024，51（2）：124-138.

Diagnosis of Parrots Infected with Klebsiella Pneumoniae

HUANG Tao1， LIU Jinfeng2， LIN Zhongyin3， JU Yan3， JIANG Yifei3，

ZHAO Qiaoya3， MA Xiuli3

（1.Nanjing Agricultural University，College of Veterinary Medicine，Nanjing 210095，China;

2. Yinan County Animal Husbandry Bureau，Yinan 276300，China;

3.Poultry Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100，China）

Abstract： Parrots， bred in a farm in Shandong Province， exhibited a series of symptoms such as respiratory distress and caseous-like secretions in the nasal cavity. The nasal secretions and lung tissue from deceased parrots were collected for bacterial isolation. It was preliminarily confirmed that this case was caused by subspecies of Klebsiella pneumoniae through biochemical assays， 16S rDNA sequencing， and phylogenetic analysis. Antimicrobial susceptibility test showed that this strain is resistant to most antibiotics but highly sensitive to florfenicol and ofloxacin， while exhibiting moderate sensitivity to polymyxin B and amikacin. This study provides a theoretical evidence and reference for the clinical diagnosis and treatment of Klebsiella pneumoniae infections in parrots.

Keywords： Parrot; Klebsiella pneumoniae; Isolation and identification; Antimicrobial susceptibility test