大狼毒次生代谢物分析及主要物质化感效应研究

摘要：为探究有毒植物大狼毒（Euphorbia jolkinii） 含有的主要化感活性物质及化感效应，本试验运用超高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS） 对大狼毒次生代谢物进行分析，并采用生物测试法，开展3种代表性次生代谢物对多年生黑麦草（Lolium perenne） 和红三叶（Trifolium pratense） 种子萌发及幼苗生长的影响研究。结果表明：大狼毒根、茎叶分别含有898种和1025种次生代谢物，分属酚酸类、氨基酸及其衍生物、脂质、黄酮和生物碱等。4-硝基苯酚、奎宁酸和2-苯乙胺等代谢物在根、茎叶中均有检测到且相对丰度较高，对多年生黑麦草和红三叶种子萌发及生长均起到显著的抑制作用（Plt;0.05），抑制效果存在代谢物差异和“浓度效应”，以4-硝基苯酚抑制最强，2-苯乙胺次之，奎宁酸最弱。综上，大狼毒植株体内次生代谢物种类多，其中4-硝基苯酚和2-苯乙胺等代谢物化感效应较明显，为大狼毒潜在化感活性物质资源化开发利用提供参考依据。

关键词：大狼毒；次生代谢物；种子萌发；幼苗生长；化感效应

中图分类号：S481""" 文献标识码：A"""" 文章编号：1007-0435（2024）08-2599-08

Analysis and Study of Secondary Metabolites and Allelopathic Effects of

Main Substances of Euphorbia jolkinii

DUAN Rui1#， LUO Qin1#， XIAO Xue1， NIU Qiong-mei1， LIU Yang2，

GUI Bao-lin3， ZHONG Li-qiong4， CHU Xiao-hui1*， SHAN Gui-lian1*

（1. Department of Grassland Science， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan Province 650201， China;

2. Forestry and Grassland Bureau of Yunnan Province， Kunming， Yunnan Province 650224， China; 3. Soil and Fertilizer

Workstation， Xundian County Agriculture and Rural Bureau，Xundian， Yunnan Province 655200， China; 4. Agricultural

Comprehensive Service Center of Yangjie Town in Xundian County， Xundian， Yunnan Province 655209， China）

Abstract：In order to investigate the main allelopathic active substances and allelopathic effects of toxic plant Euphorbia jolkinii，we used UPLC-MS/MS to analyse the secondary metabolites of E. jolkinii and bioassay to carry out a study on the effects of three representative secondary metabolites on seed germination and seedling growth of Lolium perenne and Trifolium pratense. The results showed that the roots，stems and leaves of E. jolkinii respectively contained 898 and 1 025 secondary metabolites，which belonged to phenolic acids，amino acids and their derivatives，lipids，flavonoids，alkaloids，organic acids，etc. 4-nitrophenol，quinic acid and 2-phenylethylamine were all detected in roots，stems and leaves with relatively high abundance，and had significant inhibitory effects on seed germination and growth of Lolium perenne and Trifolium pratense （Plt;0.05）. The inhibitory effects existed in the differences of metabolites and the \"concentration effect\"，with 4-nitrophenol inhibiting the strongest，following by 2-phenylethylamine and quinic acid. In conclusion，there were many types of secondary metabolites in E. jolkinii plants，among which 4-nitrophenol and 2-phenylethylamine had obvious allelopathic effects，which provided reference for resource utilization of potential allelopathic active substances in E. jolkinii.

Key words：Euphorbia jolkinii;Secondary metabolite;Seed germination;Seedling growth;Allelopathic effect

大狼毒（Euphorbia jolkinii） 为大戟科大戟属多年生草本植物，广泛分布于滇西北亚高山草甸、山坡、灌丛等地［1-3］。该物种根系发达，全株具有毒性，抗寒抗旱性强，其在退化草地上的滋生蔓延会导致伴生植物密度下降，生物量降低［4-5］，进而引起草地群落结构发生改变，严重影响当地草地畜牧业发展和生物多样性保护。

化感作用（Allelopathy） 是植物或微生物的代谢分泌物（化感物质）对周围环境中其他植物或微生物有利或有害的作用。化感物质大致可归为水溶性有机酸、脂类、长链脂肪酸和多炔、醌类、氨基酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素、黄酮、单宁、萜烯和甾族化合物、氨基酸和多肽、生物碱和氰醇、硫化物和芥子油苷和嘌呤和核酸等14类［6］，其作为植物化感作用的媒介，通过挥发、雨雾淋溶、残体或凋落物分解和根系分泌等自然途径释放并进入环境，被受体植物吸收而起作用［7］。

化感作用是毒害草占据入侵地群落优势地位的有效工具［8-10］。就滇西北亚高山草甸“霸主”植物大狼毒而言，课题组前期研究发现大狼毒根、茎叶浸提液含有的化感物质会打破受体植物的生理平衡［11］，抑制其幼苗激素合成［3］，影响受体植物的种子萌发和幼苗生长。除化感作用外，课题组前期通过测定大狼毒入侵及非入侵地土壤微生物种类及群落结构，发现大狼毒会通过向土壤环境释放化感物质的方式改变入侵地土壤微生物优势菌组成、占比及群落结构［12］。前期的这些研究结果充分说明化感作用是造成大狼毒入侵扩散区草地植物多样性下降的原因之一。然而，大狼毒植株体内究竟含有哪些主要化感活性物质？这些次生代谢物化感强度如何？据此，本研究采集旺盛生长期大狼毒植株，运用UPLC-MS/MS对其体内含有的次生代谢物进行测定。根据测定结果，选取4-硝基苯酚、2-苯乙胺和奎宁酸3种代表性次生代谢物，采用生物测试法开展其对多年生黑麦草（Lolium perenne） 和红三叶（Trifolium pratense） 的化感强度。通过研究探讨大狼毒主要化感活性物质及其化感强度，为大狼毒潜在化感活性物质资源化开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 大狼毒植株的获取 2022年8月中上旬大狼毒生长旺盛期，于云南省迪庆州香格里拉市托木南国家级草原固定监测样点（27°29′00″N，99°52′16″E） 挖取3年生以上大狼毒完整植株，将根和茎叶分开，洗净，置于干冰中封存送至北京百迈克生物科技有限公司，运用UPLC-MS/MS对其次生代谢物进行鉴定。

1.1.2 受体材料来源及特性 受体材料为‘麦迪’多年生黑麦草（L. perenne ‘Mathilde’，千粒重约3.17 g，纯净度98%） 和‘炫丽’红三叶（T. pratense ‘Brilliant’，千粒重约1.68 g，纯净度98%），由北京正道种业有限公司提供。

1.2 试验设计

本试验运用UPLC-MS/MS对大狼毒根、茎叶中的次生代谢物进行检测，根据测定结果，明确大狼毒次生代谢物。依据相对定量值及其物质类别，从相对丰度排名前30的物质中筛选出根、茎叶均有检测到的具有化感活性的3大类物质，分别为：酚酸类（4-硝基苯酚）、生物碱（2-苯乙胺）和有机酸（奎宁酸），以分析纯化学试剂代替其进行化感强度的生物测试［13］。

开展3种主要次生代谢物化感强度的生物测试时，依据预试验及各次生代谢物的丰度，将4-硝基苯酚的浓度设定为0（设为对照），10，30，50，70 mg·L-1，2-苯乙胺的浓度设定为0（设为对照），100，400，800，1200 μL·L-1，奎宁酸的浓度设定为0（设为对照），100，400，800，1200 mg·L-1，每个处理设3次重复。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 大狼毒次生代谢物测定 将大狼毒根、茎叶样品置于冻干机中真空冷冻干燥，然后用研磨机研磨成粉末。称取100 mg粉末，溶于1.2 mL70%甲醇提取液中，每30 min涡旋一次，每次持续30 s，共6次。将样品置于4℃冰箱中过夜，离心，吸取上清液并用微孔滤膜过滤，储存在注射瓶中按照仪器工作条件测定。

液相条件主要包括：色谱柱：Agilent SB-C18 （2.1 mm∶100.0 mm，1.8 μm）；流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脱梯度：0.00 min B相比例为5%，9.00 min内B相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，10.00—11.10 min，B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱温40℃；进样量4 μL。

质谱条件主要包括：LIT和三重四极杆（QQQ） 扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP），AB6500 Q TRAP UPLC/ MS/ MS系统上获得的，该系统配备了ESI Turbo离子喷雾接口，可由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex） 控制运行正负两种离子模式。

基于百迈客平台代谢数据库，对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度（CPS），用MultiaQuant软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作。

1.3.2 主要次生代谢物化感强度测定 采用培养皿滤纸法进行种子萌发试验。分别挑选100粒饱满种子，用2%的次氯酸钠溶液消毒20 min，浸泡20 min，用自来水冲洗3次，蒸馏水冲洗2次，放入培养皿中，以双层滤纸作为培养基，用相应浓度的次生代谢物溶液湿润滤纸，在温度（25±1）℃，14 h光照/10 h黑暗，光强6000 lx的人工智能光照培养箱中进行发芽试验。每处理设置3次重复。发芽试验开始时添加3 mL相应浓度的次生代谢物溶液（对照组添加等量蒸馏水），逐日观察记录发芽种子并补充蒸发的水分，使各处理液浓度维持不变，计数持续进行到经过3 d再无种子发芽为止。发芽结束后参照李春英等［14］的方法计算发芽率。参照单贵莲等［3］的方法取样测定单株鲜重、株高和根长。

1.4 数据处理

采用Excel 2016软件进行数据处理及作图，用SPSS 27.0统计软件对数据进行One-way ANOVA方差分析及Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 大狼毒次生代谢物分析

如表1所示，通过对大狼毒生长旺盛期的根、茎叶进行分析，检测出大狼毒根部含有898种次生代谢物，茎叶含有1025种次生代谢物，它们分属于酚酸类、氨基酸及其衍生物、脂质、黄酮、生物碱、有机酸、核苷酸及其衍生物、木脂素和香豆素、鞣质、萜类、醌类和其他类12大类。其中，以酚酸类数量最多，其在根、茎叶中的种数分别有190种和220种，分别占总量的21.158%和21.463%；其次是氨基酸及其衍生物和脂质，分别有129种和174种，分别占总量的14.365%和16.976%；脂类和黄酮类物质种类也较多，相对占比在12%以上。

表2是依据总离子流程图各色谱峰筛选获得的大狼毒根、茎叶中丰度前30的次生代谢物。由表2可知，在大狼毒根和茎叶两个组织中次生代谢物有所不同，具体如下：大狼毒根部丰度前30的次生代谢物包含酚酸类（10种），有机酸（4种），鞣质（4种），脂质（3种），氨基酸及其衍生物（3种），生物碱（2种），核苷酸及其衍生物（1种），以及其他类（3种）。大狼毒茎叶中丰度前30的次生代谢物包含酚酸类（9种），氨基酸及其衍生物（7种），黄酮（5种），生物碱（4种），脂质（2种），有机酸（1种），木脂素和香豆素（1种），以及核苷酸及其衍生物（1种）。可以看出酚酸类、氨基酸及其衍生物、生物碱、有机酸、脂质五大类物质是大狼毒根、茎叶均有检测到且含量最高的次生代谢物，其中4-硝基苯酚、L-正亮氨酸*、2-苯乙胺、棕榈醛、奎宁酸是共有且丰度最高的酚酸类、氨基酸及其衍生物、生物碱、脂质、有机酸代表物质。

2.2 大狼毒主要次生代谢物化感效应研究

2.2.1 酚酸类代表物质化感效应研究 由图1可知，与对照相比，添加质量浓度为10，30，50，70 mg·L-1的酚酸类代表物质4-硝基苯酚显著降低了多年生黑麦草和红三叶种子的发芽率（添加10 mg·L-1对多年生黑麦草发芽率的影响除外），降低幅度随溶液浓度升高而增加（Plt;0.05）。

由表3可知，与CK相比，低于50 mg·L-1的4-硝基苯酚溶液的添加对多年生黑麦草地上部的生长有一定的促进作用，浓度增加至70 mg·L-1时，多年生黑麦草幼苗受到显著抑制。具体为：10 mg·L-1的浓度显著增加了多年生黑麦草的单株鲜重（Plt;0.05），30，50 mg·L-1的浓度显著促进了多年生黑麦草的株高（Plt;0.05），70 mg·L-1的浓度显著降低了多年生黑麦草的单株鲜重、株高和根长（Plt;0.05）。与CK相比，10，30 mg·L-1的4-硝基苯酚溶液的添加显著降低了红三叶单株鲜重、株高和根长（Plt;0.05），降低幅度随溶液浓度的增加而增加，浓度增加至50 mg·L-1时，红三叶幼苗无法存活。

2.2.2 生物碱类代表物质化感效应研究 由图2可知，与对照相比，添加质量浓度为100，400，800，1200 μL·L-1的生物碱类代表物质2-苯乙胺显著降低了2种牧草种子的发芽率（添加100 μL·L-1对红三叶发芽率的影响除外），降低幅度随溶液浓度的升高而增加（Plt;0.05）。

由表4可知，与CK相比，低于800 μL·L-1的2-苯乙胺溶液的添加对多年生黑麦草地上部的生长有一定的促进作用，浓度添加至1200 μL·L-1时，多年生黑麦草幼苗生长受到显著抑制。400 μL·L-1的浓度显著促进了多年生黑麦草的株高（Plt;0.05），1200 μL·L-1的浓度显著降低了多年生黑麦草的单株鲜重和根长（Plt;0.05）。与CK相比，100，400 μL·L-1的2-苯乙胺溶液的添加显著降低了红三叶单株鲜重、株高和根长（Plt;0.05），降低幅度随溶液浓度的增加而增加，浓度增加至1200 μL·L-1时，红三叶幼苗无法存活。

2.2.3 有机酸类代表物质化感效应研究 由图3可知，与对照相比，添加质量浓度为100，400，800，1200 mg·L-1的有机酸类代表物质奎宁酸显著降低了多年生黑麦草种子的发芽率，降低幅度随浓度升高而增加（Plt;0.05）。就红三叶种子萌发结果来看，与CK相比，低于800 mg·L-1的奎宁酸溶液的添加显著提高了红三叶种子发芽率，当浓度增加至1200 mg·L-1时，红三叶种子发芽率显著降低（Plt;0.05）。

由表5可知，与CK相比，低于800 mg·L-1的奎宁酸溶液的添加对多年生黑麦草地上部的生长有一定的促进作用，浓度增加至1200 mg·L-1时，多年生黑麦草幼苗生长受到显著抑制。具体为：100 mg·L-1的浓度显著促进了多年生黑麦草的株高（Plt;0.05），1200 mg·L-1的浓度显著降低了多年生黑麦草的单株鲜重和根长（Plt;0.05）。与CK相比，当浓度增加至1200 mg·L-1时，奎宁酸溶液的添加显著降低了红三叶的单株鲜重和根长（Plt;0.05），但不同浓度奎宁酸溶液的添加对红三叶株高无显著影响。

3 讨论

化感物质是植物在生长发育中产生的次生代谢物质［15］。植物次生代谢物在其生长发育时并不是必需的但却是其与环境相互作用不可缺少的［16-17］，它通过影响受体植物的生理生化活动而实现其化感作用［18］。因此，探究化感作用机制的关键就是分析其化感活性物质。本研究检测出大狼毒植株体内含有1000余种次生代谢物，它们分属12大类，以酚酸类数量最多，种类占比21%以上，酚酸类次生代谢物中又以4-硝基苯酚丰度最高。酚酸类物质是植物中最常见的化感物质，对植物生长和土壤活性具有破坏性的影响［19］。酚酸类次生代谢物能显著抑制植物种子萌发及幼苗生长，并引起土壤微生物群落结构发生变化［20-23］。化感效应的强度与来源部位也有关。大狼毒根浸提液对受体植物萌发生长抑制强度大于茎叶浸提液［11，24］。本研究结果发现，在丰度前30的次生代谢物中大狼毒根系的酚酸类物质高于茎叶，这可能是次生代谢物在植物组织中分布不均衡，合成和释放存在不同，导致根部和茎叶组织中的化感物质有所差异进而影响其化感强度。

种子萌发及幼苗生长抑制试验是鉴定化感作用存在的最常用方法［25］。化感物质通过影响受体生物膜系统，改变酶及其他蛋白质的活性，调控激素的合成，影响种子的吸胀作用，进而造成细胞伤害，植物体内活性氧自由基代谢失衡，导致膜系统结构、功能受损，最终表现为种子萌发及幼苗生长均受影响［24，26-28］。化感作用还具有一定的浓度效应，低浓度的化感物质可能会促进植物生长，但当其累积量高于某一浓度阈值时就会产生抑制作用，同一种次生代谢物下，不同浓度和受体材料其化感敏感性也存在差异［29-30］。本研究表明，酚酸类代表物质4-硝基苯酚对受体植物的萌发生长均具有显著抑制作用，高浓度下抑制强度增强，且多年生黑麦草较红三叶更耐化感。此研究结果与宋亮等［22］、陶茸等［23］研究得出酚酸类次生代谢物对受体植物萌发生长均具有化感自毒作用，抑制效应与浓度显著相关的结果基本一致。2-苯乙胺和奎宁酸的添加对受体植物萌发及生长表现出明显的低浓度下促进、高浓度下抑制的双重作用，此结果与马银山等［31］、牛琼梅等［32］研究受试牧草的化感响应中得出的结论相符，其原因可能是低浓度下的化感物质有限，未能有效抑制受体植物萌发及生长。

本研究通过检测得出大狼毒植株体内次生代谢物种类多，组成较复杂，并对丰度较高的3种次生代谢物进行了生物活性检测，表明这些次生代谢物具有化感效应。本研究仅开展了对2种受体试验植物化感敏感性的比较，材料相对偏少，后续建议进一步开展有针对性的杂草受试材料对大狼毒化感耐受性的比较研究，以促进大狼毒植株体内潜在化感活性物质加以开发利用，为研发植物源新型除草剂提供参考依据。

4 结论

大狼毒植株含有12类1000余种次生代谢物，茎叶所含次生代谢物种类（1025种）高于根（898种）。4-硝基苯酚、奎宁酸、2-苯乙胺等次生代谢物在根、茎叶中均有检测到且相对丰度较高，对多年生黑麦草和红三叶均具有不同程度的抑制作用，4-硝基苯酚抑制效果最强，2-苯乙胺次之，奎宁酸最弱。推断4-硝基苯酚和2-苯乙胺具有开发为植物源除草剂或成为除草剂中间体的潜力，今后需对相应的杂草进行试验，并对其控草机制机理进行深入研究。

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（责任编辑 彭露茜）