基于抗寒系数对“WL”系列苜蓿品种抗寒性的综合评价

摘要：为了阐明科尔沁沙地不同秋眠级苜蓿（Medicago sativa）品种抗寒性与抗寒生理特性的关系，选取12个不同秋眠级的“WL”系列苜蓿品种作为供试材料，采用单因素随机区组试验设计，于科尔沁沙地种植，封冻前取苜蓿越冬器官（苜蓿根系），模拟4℃（CK）和-20℃低温胁迫处理，测定苜蓿根颈的抗氧化特性和抗寒保护物质含量，利用抗寒系数结合相关性分析、主成分分析、聚类分析和隶属函数分析，对其抗寒能力进行了评价。结果表明：（1）秋眠级与过氧化物酶的抗寒系数呈极显著负相关（Plt;0.01），与丙二醛和淀粉的抗寒系数呈极显著正相关（Plt;0.01）。（2）聚类分析可将12个苜蓿品种分为3组，第1组‘WL168HQ’秋眠型品种；第2组为‘WL329HQ’‘WL319HQ’‘WL298HQ’秋眠型和‘WL349HQ’半秋眠型品种，第3组则是其他半秋眠型品种。（3）通过主成分分析将8个单一指标转化为3个综合指标，累计贡献率达80.20%。（4）隶属函数综合评价表明‘WL168HQ’苜蓿品种最适宜科尔沁沙地种植。

关键词：紫花苜蓿；品种；秋眠级；抗寒系数；综合评价

中图分类号：S541""" 文献标识码：A"""" 文章编号：1007-0435（2024）08-2592-07

Comprehensive Evaluation of Cold Resistance of Alfalfa Varieties of the “WL”

Series Based on Cold Resistance Coefficients

LIU Ze-yu1， YUAN Zi-tong1， SUI Ke1， ZHANG Yu-xia1， LIU Ting-yu1，

SHAN Xin-he2， ZHANG Zhi-yong3， WANG Xian-guo2*

（1.Key Laboratory of Ecological Agriculture in Horqin Sandy Land， College of Prataculture， Inner Mongolia Minzu University/

State Ethnic Affairs Commission， Tongliao，Inner Mongolia 028000， China; 2. College of Pratacultural Science and Technology，

China Agricultural University， Beijing 100193; 3. Tongliao Institute of Agriculture and Animal Husbandry Science， Tongliao，

Inner Mongolia 028000， China）

Abstract：In order to clarify the relationship between cold resistance and cold resistance physiological characteristics of alfalfa（Medicago sativa） varieties with different fall dormancy levels in Horqin Sandy Land，12 “WL” series alfalfa varieties with different fall dormancy levels were selected as test materials. Single factor randomized block experiment design was used to plant alfalfa in Horqin Sandy Land. Before freezing，take the overwintering organs （alfalfa roots） of alfalfa，simulate low temperature stress treatment at 4℃ （CK） and -20℃，and measure the antioxidant properties and content of cold resistant protective substances in the alfalfa root neck. The cold resistance ability of alfalfa was evaluated by utilizing the cold resistance coefficient and combining correlation analysis，principal component analysis，cluster analysis，and membership function analysis. The results showed that：（1） The autumn dormancy level is significantly negatively correlated with the cold resistance coefficient of peroxidase （P＜0.01），and significantly positively correlated with the cold resistance coefficient of malondialdehyde and starch （P＜0.01）. （2） Cluster analysis of cold resistance coefficients of 12 alfalfa varieties can be divided into 3 groups. The 1 st group includes ‘WL168HQ’ fall dormancy varieties，the 2nd group includes ‘WL329HQ’、‘WL319HQ’and ‘WL298HQ’ fall dormancy varieties，as well as ‘WL349HQ’ semi-dormant varieties. The 3rd group consists of other semi-dormant varieties. （3） Through principal component analysis，8 single indicators were transformed into 3 comprehensive indicators， the cumulative contribition rate was 80.20%. （4） The comprehensive evaluation of membership function showed that ‘WL168HQ’ alfalfa variety was the most suitable one for alfalfa planting in Horqin Sandy Land.

Key words：Alfalfa;Varieties;Fall dormancy;Cold resistance coefficient;Comprehensive evaluation

作为我国北方栽培面积最大的豆科牧草，苜蓿（Medicago sativa）因其适应能力强，营养价值高而享有“牧草之王”之美誉［1］。内蒙古科尔沁地区是我国北方优质的苜蓿生产种植基地，但该地区冬季低温寒冷降水较少，春季气温不稳定经常发生“倒春寒”等极端天气，苜蓿极易受到冻害的威胁，故在该地区种植苜蓿时，抗寒性是品种选择的关键因素［2］。秋眠级（Fall dormancy，FD）是苜蓿对晚秋环境（日照时数减少）变化适应性反应，植株表现为由向上生长转向匍匐生长，致使总产量减少的一种生长特性，它与产量和抗寒性密切相关，已成为北美评定苜蓿品种生产性能的重要参考指标［3-4］。大量研究表明［5-9］，秋眠级与抗寒性存在着负相关的关系。抗寒性越强的品种其秋眠级越低，可以更好适应寒冷的环境。卢欣石等［10］对国内23个审定苜蓿品种及92个地方品种的秋眠级进行了测定，发现苜蓿秋眠级与其耐寒能力有直接关系，秋眠性强的苜蓿品种，其抗寒能力较强。

当前针对苜蓿抗寒性的问题已有大量学者进行了研究，其中王晓龙等［11］和马亚珺等［12］采用人工模拟低温的方法，对不同苜蓿品种幼苗进行抗寒锻炼，研究其抗寒性；王晓龙等［13-15］通过研究苜蓿的根系形态来确定根系性状与抗寒性之间的关系。赵金梅等［16-18］通过研究苜蓿根颈细胞的渗透调节物质及抗氧化酶的活性来判断苜蓿的抗寒性，对“WL”系列苜蓿的研究前人主要集中生产性能［19-20］，对抗寒性的研究鲜有，刘泽宇等［21］对“WL”系列苜蓿的抗寒性研究主要集中在抗氧化特性对抗寒性的影响。基于抗寒系数评价植物抗寒性的研究，甘蓝［22］、荞麦［23］和月季［24］等植物研究较多，关于苜蓿［25］的研究较少，基于此，本研究于越冬前挖取“WL”系列不同秋眠级苜蓿品种的越冬器官，在程序式低温处理箱模拟低温冷冻处理，以低温冷藏处理为对照，测定不同温度下抗氧化特性和抗寒保护物质含量的变化，利用抗寒系数进行相关性分析、主成分分析、聚类分析以及隶属函数分析，对各个品种的耐寒性进行分类排序，筛选高抗寒的品种，以期为科尔沁沙地苜蓿抗寒影响机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为美国“WL”系列紫花苜蓿品种，均由北京正道种业公司提供。具体品种信息见表1。

1.2 试验设计

本试验于2023年4—11月在内蒙古通辽市科尔沁区钱家店镇（通辽市农牧科学研究所试验基地）进行。海拔203 m，122°37′E，43°43′N。属温带大陆性气候。春季干旱多风；夏季短温热，降水集中；秋季凉爽；冬季干冷。无霜期为90～150 d。年降雨量350～450 mm。土质为白壤土，地势平坦，肥力中上等，土壤基本理化性质为有机质26.0 g·kg-1，速效磷17.0 mg·kg-1，速效钾76.6 mg·kg-1，碱解氮47.5 mg·kg-1，全氮0.8 g·kg-1。

采用单因素随机区组试验设计，2023年4月播种，播种量为22.5 kg·hm-2，行距为15 cm，小区面积为20 m2（长4 m×宽5 m），每个处理3次重复，共36个小区。试验田按照当地苜蓿高产田进行田间管理。分别于6月26日、8月1日、8月31日进行3茬苜蓿的刈割利用。本试验于封冻前期，挖取长势均匀一致的越冬器官（苜蓿根系）若干带回室内，模拟低温冷藏和低温冷冻胁迫处理。即将用蒸馏水洗净吸干浮水后的苜蓿越冬器官分成均匀的两份，每份40株，并排整齐摆放在厚度为3 mm，长为30 cm、宽为20 cm的纯棉布上，包裹好，均匀喷洒30 mL蒸馏水，使棉布保持潮湿状态，最后用长×宽为30 cm×30 cm锡箔纸包好。其中一份存放于4℃的冰箱冷藏，另一份放入可程式恒温恒湿试验箱中进行-20℃的低温处理。可程式恒温试验箱的设置［14］：以4℃为起点，先以4℃·h-1的速率升温，到达设定温度后保持8 h，后以4℃·h-1的速率降温，取出后置于4℃下保持12 h，然后进行指标测定，指标测定时采用随机取样。低温冷冻处理完成后与低温冷藏材料一同切取根颈下方1 cm长度的薄片，用于测定抗氧化特性和抗寒保护物质含量等生理指标。

1.3 测定的指标与方法

生理指标的测定参照邹琦［26］植物生理学实验指导方法：丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性、过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性分别采用硫代巴比妥酸法、氮蓝四唑法紫外吸收法、愈创木酚比色法测定。可溶性蛋白（Soluble protein，SP）、游离氨基酸（free amino acid，AA）含量分别采用考马斯亮蓝比色法、水合茚三酮法测定，可溶性糖（Soluble sugar，SS）和淀粉（Starch，ST）含量的测定采用蒽酮比色法。每项生理指标测定设3次重复。

1.4 数据处理

1.4.1 单项指标的抗寒系数

抗寒系数（ω）=低温冷冻数值/低温冷藏数值（1）［25］

1.4.2 各生理指标抗寒系数的隶属函数值 采用模糊数学隶属函数法对苜蓿的耐寒性进行综合评价。首先，通过相关性分析确定最终用于评价的指标，并计算出各指标的隶属函数值［23］，如果某一指标和抗寒性呈正相关，则采用公式（1）进行计算，如果某一指标和抗寒性呈负相关，则采用公式（2）进行计算：

Fij=Xij-Ximin/Ximax-Ximin （2）

Fij=1-Xij-Ximin/Ximax-Ximin（3）

式中：Fij为i品种j指标隶属函数值；Xij为i品种j指标值；Ximax为i品种j指标最大值；Ximin为i品种j指标最小值。将i品种各项指标函数值累加后求平均值，均值越大则苜蓿品种耐寒性越强。

1.4.3 各综合指标的权重

ωj=pj/∑nj=1pjj=1，2，…，n（4）

式中，ωj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；pj代表经主成分分析所得各苜蓿越冬材料第j个综合指标的贡献率。

1.4.4 各苜蓿越冬材料的综合抗寒能力大小

D=∑nj=1［μ（Xj）×ωj］j=1，2，…，n（5）

式中，D值为各苜蓿根颈在低温冷冻胁迫处理下由综合指标评价所得的抗寒性综合评价值。

1.5 统计分析

用Microsoft Excel 2021进行数据的录入及整理。采用SPSS 26.0（IBM，美国）统计软件中的单因素方差分析（One-way ANOVA），并进行相关性分析、主成分分析、聚类分析和隶属函数综合评价。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下苜蓿各生理指标变异统计

低温胁迫下苜蓿的8个生理指标的测定结果变异统计显示（表2），不同材料的同一生理指标的抗寒系数存在较大差异。此外，不同指标的变异系数变化较大，变异系数为0.050～0.326，表明所测定指标对于低温胁迫响应程度各不相同。在8个指标中以SOD，AA，SS的变异系数较大，分别为0.326，0.245和0.206，MDA的变异系数较小为0.050。

2.2 各单项指标的抗寒系数

由表3可知，不同苜蓿品种在同一指标下的抗寒系数不同，不同指标下同一苜蓿品种的抗寒系数也有差异，‘WL319HQ’的POD抗寒系数最大为1.879，‘WL298HQ’次之，为1.747。‘WL168HQ’的SOD和SS的抗寒系数最高为2.037和3.521。‘WL349HQ’的CAT抗寒系数最高为1.809。‘WL168HQ’的MDA抗寒系数最低为1.916。‘WL319HQ’的ST抗寒系数最低为0.105。‘WL363HQ’的游离氨基酸抗寒系数最高为1.859。‘WL329HQ’的可溶性蛋白抗寒系数最高为2.180。不同品种的苜蓿在低温胁迫下，对根颈细胞起到保护作用的抗氧化酶以及渗透调节物质的抗寒系数不同。

2.3 不同单项生理指标抗寒系数与秋眠级相关性分析

对不同单项指标的抗寒系数与秋眠级进行相关性分析可知（表4），秋眠级与POD抗寒系数呈极显著负相关（Plt;0.01），相关系数为-0.798，与MDA和ST抗寒系数呈极显著正相关（Plt;0.01），相关系数分别为0.866和0.709。各单项生理指标间，MDA抗寒系数与CAT和POD的抗寒系数呈极显著负相关（Plt;0.01），与ST呈极显著正相关（Plt;0.01）。ST的抗寒系数与POD抗寒系数呈极显著负相关。

2.4 主成分分析

对8个生理指标进行主成分分析（表5），前3个主成分（F1，F2，F3）的贡献率分别为41.72%，20.22%，17.27%，其中F1对应的特征向量中贡献较大的指标为ST（0.880）和SP（0.805）；F2对应的特征向量中贡献较大的指标为SS（0.658）和CAT（0.656）；F3对应的特征向量中贡献较大的指标为SS（0.882）和CAT（0.382）；F4对应的特征向量中贡献较大的指标为CAT（0.607）和SS（0.604）。因此将8个单一指标转化为3个综合指标，累计贡献率达80.20%。

2.5 隶属函数分析

为避免单一生理指标评价苜蓿抗寒性的片面性，基于主成分分析对12个苜蓿品种进行隶属函数综合评价表明（表6），其抗寒性强弱顺序依次为：‘WL168HQ’（0.76）gt;‘WL329HQ’（0.65）gt;‘WL319HQ’（0.64）gt;‘WL349HQ’（0.51）gt;‘WL298HQ’（0.47）gt;‘WL354HQ’（0.46）gt;‘WL343HQ’（0.41）gt;‘WL377HQ’（0.38）gt;‘WL358HQ’（0.36）gt;‘WL366HQ’（0.34）gt;‘WL363HQ’（0.30）gt;‘WL440HQ’（0.25）。

2.6 聚类分析

根据隶属函数值对12个苜蓿品种进行聚类分析，将其分为3组（图1），第1组‘WL168HQ’秋眠型品种：第2组为‘WL319HQ’‘WL298HQ’‘WL329HQ’秋眠型和‘WL349HQ’半秋眠型品种；第3组包括‘WL354HQ’‘WL343HQ’‘WL358HQ’‘WL440HQ’‘WL366HQ’‘WL363HQ’和‘WL377HQ’半秋眠型品种。

2.7 苜蓿抗寒性与秋眠级的相关性

利用线性回归法，对不同品种苜蓿抗寒性的隶属函数综合评价值与秋眠级进行回归分析，建立抗寒性与秋眠级的一元线性回归方程（图2），苜蓿抗寒性与秋眠级呈负相关（R2=0.78），秋眠级越低的品种，苜蓿抗寒性越强。

3 讨论

苜蓿的抗寒性由环境胁迫和自身的遗传特性所决定，低温胁迫下苜蓿的生理反应直接或者间接影响着其抗寒性［26］。研究不同品种苜蓿的抗寒性，筛选耐寒品种对于促进牧草产业的发展具有重要意义。对于苜蓿抗寒性的评价，前人的研究主要集中在苜蓿的萌芽期和苗期［12，18］，这些研究通常采用光照培养箱模拟低温处理进行抗寒鉴定，此方法操作简单，不易受到外界环境的影响。本试验采取在霜冻前期挖取苜蓿根系进行模拟低温胁迫的研究，采用可程式恒温恒湿箱可以更接近真实的越冬情况。另外，本研究在内蒙古通辽市进行试验，更能准确的评价苜蓿在科尔沁沙地的实际抗寒性。

苜蓿抗寒性评价主要是从植物生理学角度来研究苜蓿本身生理生化特性及其对低温胁迫的响应［27-30］，鉴定植物抗寒性的指标有很多，本研究运用人工模拟低温处理，基于苜蓿的抗氧化特性、抗寒保护物质的8个生理指标，计算12个苜蓿品种的抗寒系数，运用相关分析发现，秋眠级与POD的抗寒系数呈极显著负相关（Plt;0.01），与MDA和淀粉抗寒系数呈极显著正相关（Plt;0.01），这与孙昊等［25］的研究相一致；主成分分析发现，SP和SS是影响苜蓿抗寒性的主要生理指标，这与陈卫东［31］的研究结果相一致，与张玉霞等［32］研究结果不一致，其原因可能与供试的苜蓿品种不同有关。利用线性回归法，对不同品种苜蓿抗寒性的隶属函数综合评价值与秋眠级进行回归分析发现，苜蓿抗寒性与秋眠级呈负相关（R2=0.78），秋眠级越低的品种，苜蓿抗寒性越强。

4 结论

对苜蓿抗寒性和秋眠级进行相关性分析表明，苜抗寒性与秋眠级呈显著负相关，秋眠级指数越低，抗寒性越强。12个苜蓿品种中，‘WL168HQ’‘WL319HQ’‘WL298HQ’和‘WL349HQ’具有较强的抗寒性和较低的秋眠级，主成分分析将8个单一指标转化为3个综合指标，累计贡献率达80.20%。运用隶属函数进行综合评价得出，品种抗寒性顺序为：‘WL168HQ’（0.76）gt;‘WL329HQ’（0.65）gt;‘WL319HQ’（0.64）gt;‘WL349HQ’（0.51）gt;‘WL298HQ’（0.47）gt;‘WL354HQ’（0.46）gt;‘WL343HQ’（0.41）gt;‘WL377HQ’（0.38）gt;‘WL358HQ’（0.36）gt;‘WL366HQ’（0.34）gt;‘WL363HQ’（0.30）gt;‘WL440HQ’（0.25）。

综上，建议在科尔沁沙地种植“WL”系列紫花苜蓿品种为‘WL168HQ’。

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（责任编辑 刘婷婷）