基于快速蒸发电离质谱技术鉴别咖啡掺伪

摘要：对咖啡及其掺伪物黑豆、黑玉米以及不同比例掺伪咖啡样品进行评估，采用快速蒸发电离质谱（REIMS）采集各样品一级全扫质谱数据，构建样品主成分分析-线性判别分析（PCA-LDA）模型，并进行leave-20%-out模式验证。结果表明，咖啡粉、黑豆粉及黑玉米粉样品的识别正确率为100.00%，咖啡粉、黑豆粉及不同比例黑豆粉掺伪咖啡粉样品的识别正确率为97.07%，咖啡粉、黑玉米粉及不同比例黑玉米粉掺伪咖啡粉样品的识别正确率为96.60%，可以较好地区分咖啡、黑豆、黑玉米以及不同比例掺伪咖啡样品，构建的模型可实现样品的瞬时实时识别。采用Live ID软件对随机的原料样品和不同比例（5%、10%、20%、30%、40%、50%）掺伪咖啡样品进行实时识别，结果表明各样品均被正确识别，掺伪比例检出限最低可达5%。该方法可高效、快速、准确地监测咖啡掺伪情况，有效满足咖啡样品中掺伪黑豆和黑玉米的鉴别需求。

关键词：快速蒸发电离质谱；咖啡；掺伪；PCA-LDA模型

中图分类号：TS255.1" " " " "文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）12-0171-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.031 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Identification of coffee adulteration based on rapid evaporation ionization mass spectrometry technology

WU Wan-qin1，2， JIANG Feng1，2， FAN Xiao-long1，2， LI Xing1，2， ZHU Song-song1，2，

WANG Wei1，2， ZHANG Li1，2， ZHANG Ya-zhen1，2， ZHU Xiao-ling1，2， FENG Meng3

（1.Key Laboratory of Detection Technology of Focus Chemical Hazards in Animal-derived Food for State Market Regulation/NHC Specialty Laboratory of Food Safety Risk Assessment and Standard Development，Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test ，Wuhan" 430075， China；2.Hubei Shizhen Laboratory， Wuhan" 430065，China；3.Waters Technology （Shanghai） Co.， Ltd.， Shanghai" 201206， China）

Abstract： Coffee and its adulterated black soybean， black corn， and coffee samples with different proportions of adulteration were evaluated， rapid evaporation ionization mass spectrometry （REIMS） to was used collect primary full scan mass spectrometry data of each sample， a sample principal component analysis linear discriminant analysis （PCA-LDA） model was constructed， and the leave-20%-out mode was validated. The results showed that the correct recognition rate of coffee powder， black soybean powder and black corn powder samples was 100.00%， the correct recognition rate of coffee powder， black soybean powder and different proportion of black soybean powder adulterated with coffee powder samples was 97.07%， and the correct recognition rate of coffee powder， black corn powder and different proportion of black corn powder adulterated with coffee powder samples was 96.60%. Coffee， black soybean， black corn and different proportion of adulterated coffee samples could be better distinguished. The model constructed could achieve instantaneous real-time recognition of samples. Real time identification of random raw material samples and coffee samples with different proportions （5%， 10%， 20%， 30%， 40%， and 50%） of adulteration was carried out using Live ID software. The results showed that all samples were correctly identified， and the detection limit of adulteration proportion could reach as low as 5%. This method could efficiently， quickly， and accurately monitor coffee adulteration， effectively meeting the identification needs of adulterated black soybean and black corn in coffee samples.

Key words： rapid evaporation ionization mass spectrometry； coffee； adulteration； PCA-LDA model

收稿日期：2023-10-13

基金项目：湖北省市场监督管理局科技计划项目（Hbscjg-KJ2021002）；湖北省自然科学基金项目（2022CFB789）

作者简介：吴婉琴（1991-），女，湖北荆州人，工程师，主要从事食品安全检测研究，（电话）15327117381（电子信箱）429371379@qq.com；通信作者，汪 薇（1989-），女，湖北武汉人，高级工程师，主要从事食品安全检测研究，（电子信箱）291668142@qq.com。

咖啡是一种广受欢迎的高价值食品，有些生产商受经济利益驱使对咖啡进行掺伪，虽然它们不一定会对消费者的健康造成风险，但这种行为欺骗了消费者和按照合法工艺生产的企业。欧盟曾发布有关“食品安全与食品掺假”调查报告，列出10大易掺假食品名单，咖啡位列第七，这表明咖啡掺假已在行业中普遍存在［1］。目前咖啡掺伪的原料主要有莓果粉［2-5］、黑玉米粉［6，7］、大麦粉［8，9］、大豆粉［10，11］等。

近年来，大量的仪器分析技术已被用于鉴别咖啡掺假，主要有光谱检测技术、色谱/质谱检测技术、分子生物学检测技术等。光谱检测技术包括红外光谱技术［6］、多光谱成像技术［12］、核磁共振技术［13-15］、同步前表面荧光光谱技术［11］等，色谱/质谱检测技术包括液相色谱技术［16，17］、液相色谱-质谱技术［18，19］、离子色谱技术［20］、稳定同位素质谱技术［21］等；分子生物学检测技术包括聚合酶链反应技术［22，23］等，但这些方法较复杂而且耗时、费力。为了应对日益严重的食品欺诈挑战，人们越来越需要简单、快速、可靠的技术，用于筛查及监测食品的真实性。

快速蒸发电离质谱法（REIMS）是一种新兴技术，能够将样品直接电离与质谱分析相结合，无需或仅需简单的样品前处理步骤即可在大气压条件下对待测物进行离子化，具有较好的特异性和灵敏度，该技术广泛应用于食品检测、化妆品检测等领域。REIMS在食品真实性测试方面有较大优势，它可以显著减少分析时间，实现样品高效分析。REIMS与高分辨率质谱相结合，获得不同食品的非靶向一级全扫质谱图谱，其可以用于构建多元统计分析算法训练和验证化学计量学模型。未知样本的实时分类可以通过相似性评分与验证模型进行比较来获得，从而可以准确、实时、快速地分析样本。

目前较少有文献报道样品的快速蒸发电离质谱分析，本研究以不同掺伪比例的咖啡样品为材料，将咖啡样品置于锡箔盘中，加入适量溶剂混合均匀成糊状，置于冰箱冷冻成块后，采用快速蒸发电离质谱采集咖啡及掺伪物黑豆、黑玉米以及不同比例掺伪咖啡样品的一级全扫质谱数据，通过构建样本PCA-LDA模型，并进行5次分层验证（leave-20%-out模式），可以较好地区分咖啡及掺伪物。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

校正内标标准品为亮氨酸脑啡肽（LeuEnk），其分子式为C28H37N5O7，CAS登记号为58822-25-6，纯度≥98%。甲醇、乙腈、异丙醇（质谱纯，德国Merck公司）；甲酸、乙酸铵（质谱纯，美国Fisher Scientific公司）；水为去离子水（电阻率为18.2 MΩ·cm，25 ℃，美国Millipore公司）；其他试剂均为分析纯。

10批次烘焙咖啡豆、10批次黑豆、10批次黑玉米样品均购自于电商平台。

Waters Xevo G2-XS型飞行时间质谱仪（配备REIMS系统，美国Waters公司）；爱尔博电子刀［爱尔博（上海）医疗器械有限公司］；粉碎机（美国J2 Scientific公司）；XS204型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

1）烘焙咖啡豆样品（编号为Coffee 1至Coffee 10）。将样品粉碎处理后过40目筛，置于密封袋中备用。

2）黑豆样品（编号为Black soybean 1至Black soybean 10）。将样品置于200 ℃条件下烘焙45 min，置于干燥皿中冷却至室温，将样品粉碎处理后过40目筛，置于密封袋中备用。

3）黑玉米样品（编号为Black corn 1至Black corn 10）。将样品置于200 ℃条件下烘焙45 min，将样品粉碎处理后过40目筛，置于密封袋中备用。

4）咖啡粉混合样品（编号为Coffee-Mix 10）。分别等质量称取粉碎过筛的10批次咖啡粉样品，反复混匀。

5）黑豆粉混合样品（编号为Black soybean-Mix 10）。分别等质量称取粉碎过筛的10批次黑豆粉样品，反复混匀。

6）黑玉米粉混合样品（编号为Black corn-Mix 10）。分别等质量称取粉碎过筛的10批次黑玉米粉样品，反复混匀。

7）模拟掺伪样品。将黑豆粉混合样品分别以不同比例（5%、10%、20%、30%、40%、50%）与咖啡粉混合样品进行混合，模拟咖啡粉的黑豆粉掺伪样品；将黑玉米粉混合样品分别以不同比例（5%、10%、20%、30%、40%、50%）与咖啡粉混合样品进行混合，模拟咖啡粉的黑玉米粉掺伪样品。

8）冰冻样品制备。分别准确称取上述过40目筛的样品粉末2 g（精确至0.01 g）于锡箔盘中，加入3 mL 5 mmol/L乙酸铵水溶液并混合均匀，置于-20 ℃冰箱冷冻20 min。

1.2.2 样品采集 采用iKnife手术电刀对冰冻样品进行采集，iKnife手术电刀电压设置为40 V，样品采集长度为0.8～1.0 cm，样品采集深度为0.2～0.3 cm，样品采集时间为2～3 s，保证每个样品重复采集10次，每个总离子流图峰时间间隔为2～3 s。样品经手术刀采集电离后产生的气溶胶通过N2气流导入至飞行时间质谱仪进行分析。

1.2.3 仪器条件 辅助溶液为0.1%甲酸-甲醇溶液（含200 ng/mL亮氨酸脑啡肽），流速为0.15 mL/min，其中校正内标物亮氨酸脑啡肽（556.277 1，m/z）用于样本质谱数据质量校正及归一化处理。

扫描模式：ESI源正离子模式，采集模式为分辨率模式，锥孔电压为40 V，质量数扫描范围为50～" " 1 200 m/z。

1.3 数据处理

采用MassLynx 4.1软件采集样品质谱数据，Live ID软件进行样品质谱数据化学计量学模型的建立、验证和未知样本实时识别。

2 结果与分析

2.1 辅助溶液的选择

辅助溶液分别为甲醇-水溶液（98∶2，体积比）、甲醇、0.1%甲酸-甲醇溶液，3种辅助溶液中均含200 ng/mL亮氨酸脑啡肽，结果显示，亮氨酸脑啡肽在0.1%甲酸-甲醇溶液中响应及分辨率更好，故选择0.1%甲酸-甲醇溶液（含200 ng/mL亮氨酸脑啡肽）作为辅助溶液。

2.2 样品溶剂的选择

选用合适的溶剂将黑豆粉样品混匀成糊状，采用冰冻方式将糊状物冰冻成块状物，一是避免干燥固体粉末样品被直接抽吸至质谱仪，二是保证粉末样品的导电性及划取样品的均匀性，三是保证样品所含化学组分检出的全面性和灵敏性。本研究分别选择3 mL水、3 mL 5 mmol/L乙酸铵水溶液、3 mL 0.1%甲酸水溶液、3 mL甲醇-水（1∶1，体积比）、3 mL乙腈-水（1∶1，体积比）、3 mL甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液（1∶1，体积比）作为混合粉末样品的溶剂，混合均匀后置于-20 ℃冰箱冷冻20 min，采用智能刀（iKnife）采集样品后进行质谱分析，结果显示，加入甲醇-水（1∶1，体积比）和乙腈-水（1∶1，体积比）的粉末样品并未冰冻成块，无法满足分析要求，在正离子扫描模式下比较其他4种溶剂混合样品的质谱采集数据（图1），正模式下，0.1%甲酸水和5 mmol/L乙酸铵水溶液作为溶剂可以保证样品质谱数据的丰富性，但5 mmol/L乙酸铵水溶液作为溶剂时样品质谱数据灵敏度更佳，综合考虑，最终选择5 mmol/L乙酸铵水溶液作为样品制备的溶剂。

2.3 iKnife手术电刀参数优化

采用iKnife手术电刀，分别在30、40、50 V电压下采集样品，结果（图2）表明，电压为30 V时，样品汽化程度不够，灵敏度较差；电压为50 V时，样品汽化程度较高且出现轻微焦黑情况，同时由于样品汽化量较大，样品质谱数据响应较高，产生较强的基质效应，抑制校正内标物亮氨酸脑啡肽的响应，影响样品质谱数据质量校正；当电压为40 V时，既可以保证样品质谱数据的丰富性和灵敏度，也可以保证校正内标物的灵敏度。iKnife手术刀电压选择40 V。

2.4 构建化学计量学模型

采用Live ID软件对正离子扫描模式下采集的咖啡粉样品、黑豆粉样品、黑玉米粉样品及不同比例黑豆粉、黑玉米粉掺伪咖啡粉样品的质谱数据进行分析，首先使用亮氨酸脑啡肽对所有质谱数据进行质量校正及归一化处理，再将预处理后的样本数据分组后构建主成分分析-线性判别分析（PCA-LDA）模型，结果显示，咖啡粉与黑豆粉、黑玉米粉样品均有显著的区分度，如图3所示；咖啡粉、黑豆粉及不同比例黑豆粉掺伪咖啡粉样品均有显著区分度，且不同掺伪比例样品存在一定的关联性，如图4所示；咖啡粉、黑玉米粉及不同比例黑玉米粉掺伪咖啡粉样品均有显著区分度，且不同掺伪比例样品存在一定的关联性，如图5所示。

2.5 化学计量学模型的验证

采用Live ID软件分别对咖啡粉、黑豆粉及黑玉米粉样品，咖啡粉、黑豆粉及不同比例黑豆粉掺伪咖啡粉样品，咖啡粉、黑玉米粉及不同比例黑玉米粉掺伪咖啡粉样品进行了5次分层验证（leave-20%-out模式），即数据集随机分为5组，任意挑选其中4组建立模型，采用该模型对剩余的1组数据进行验证，共进行5次重复，以确定模型的识别正确率，结果显示，咖啡粉、黑豆粉和黑玉米粉样品的识别正确率为100.00%（表1），咖啡粉、黑豆粉和不同比例黑豆粉掺伪咖啡粉样品的识别正确率为97.07%（表2），咖啡粉、黑玉米粉和不同比例黑玉米粉掺伪咖啡粉样品的识别正确率为96.60%（表3）。

2.6 样品实时识别

采用Live ID软件对随机的原料样品和不同比例（5%、10%、20%、30%、40%、50%）掺伪咖啡样品进行实时识别，结果表明各样品均被正确识别（图6至图10）。掺伪比例检出限最低可达5%，可有效满足咖啡样品中掺伪黑豆和黑玉米的鉴别需求。

3 小结

本研究通过创新地将粉末样品加入适宜溶剂后进行冰冻制样，采用快速蒸发电离质谱法对粉末样品进行分析，该方法既可以保证划取样品的均匀性，又可以避免采集后样品堵住智能刀尖部及被传输线气流抽至质谱仪污染仪器的情况。采用快速蒸发电离质谱法构建的咖啡及其掺伪样品模型可以快速、准确实现咖啡掺伪的识别。然而，在接下来的工作中有必要通过质谱数据挖掘等方法来探索各类别样品标记物，同时还需要对咖啡的其他易掺伪物如大麦、莓果粉等进行鉴别，以期更全面把控咖啡的掺伪情况。

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