耐热、抗根肿病、萝卜胞质雄性不育（Ogura CMS）大白菜材料的创制

摘要：为获得耐热、抗根肿病的Ogura胞质雄性不育（Ogura CMS）大白菜（Brassica rapa L. ssp. Pekinensis）材料，以耐热大白菜为母本，抗根肿病娃娃菜为父本获得F1，经鉴定后和抗根肿病Ogura胞质雄性不育娃娃菜杂交，获得CMSF1，再将F1自交获得的F2经鉴定筛选后作为父本，CMSF1鉴定筛选后作为母本进行回交，得到BC1。抗根肿病表型鉴定结果显示F1、CMSF1、BC1表现为抗病，分子标记鉴定结果显示，F1植株均携带根肿病抗性基因，CMSF1和BC1大部分植株携带根肿病抗性基因。耐热鉴定结果表明，F1、CMSF1、BC1在高温胁迫下超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性增幅大于迷您黄1号。CMSF1和BC1花器官观察结果表明雄蕊败育无花粉，是Ogura胞质雄性不育株。

关键词：大白菜（Brassica rapa L. ssp. Pekinensis）；根肿病；耐热；Ogura胞质雄性不育

中图分类号：S634.1" " " " "文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）12-0081-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.12.015 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Creation of radish cytoplasmic male sterility （Ogura CMS） Chinese cabbage breeding material with heat tolerance， clubroot resistance

ZHAO Ya-lan1，2， HU Jing-feng2，3， YANG Hong-li2， 3， DONG Xiang-shu1， HE Jiang-ming2， 3

（1.School of Agriculture， Yunnan University， Kunming" 650504， China；2. Horticultural Research Institute， Yunnan Academy Agricultural Sciences，" Kunming" 650205， China；3. Yunnan Branch of National Vegetable Improvement Center， Kunming" 650205， China）

Abstract：In order to obtain Ogura cytoplasmic male sterile Chinese cabbage materials with heat resistance and clubroot resistance， F1 was obtained by crossing heat resistant Chinese cabbage as female parent and clubroot resistant baby cabbage as male parent. After identification， CMSF1 was obtained by crossing with Ogura cytoplasmic male sterile baby cabbage with clubroot resistance. Then， F2 obtained by self-crossing F1 was selected as male parent， and CMSF1 was selected as female parent for backcrossing to obtain BC1. The results of phenotypic identification of clubroot resistance showed that F1， CMSF1 and BC1 were resistant to clubroot. The results of molecular marker identification showed that F1 plants carried clubroot resistance genes， and most of CMSF1 and BC1 plants carried clubroot resistance genes. The results of heat tolerance identification showed that the increase of SOD， POD and CAT activity of F1， CMSF1 and BC1 under high temperature stress was greater than that of Mini Yellow 1. The floral organ observation of CMSF1 and BC1 showed that the stamen abortion was without pollen， which was Ogura cytoplasmic male sterile strain.

Key words：Chinese cabbage； clubroot resistance； heat tolerance； Ogura CMS

收稿日期：2024-03-29

基金项目：国家大宗蔬菜产业技术体系项目（CARS-23-G33）；云南省“万人计划”产业技术领军人才项目（YNWR-CYJS-2018-040）；云南种子种业联合实验室项目（202205AR070001）；云南地方特色蔬菜种质资源发掘与新品种选育研究项目（202302AE090006）；2022年云南省通海县蔬菜产业科技特派团项目（202204BI090023）；云南省十字花科蔬菜育种创新团队项目（202405AS350017）

作者简介：赵雅兰（1998-），女，四川泸州人，在读硕士研究生，研究方向为十字花科蔬菜育种，（电话）13658846674（电子信箱）1604419233@qq.com；通信作者，和江明（1969-），男（纳西族），云南香格里拉人，研究员，主要从事十字花科作物生物技术育种工作，（电话）13238695391（电子信箱）hejiangming666@qq.com。

大白菜（Brassica rapa L. ssp. Pekinensis）是一种起源于中国的十字花科芸薹属蔬菜，种植历史悠久。大白菜具有品种丰富、产量高、耐储运等优点，且营养丰富，深受广大消费者喜爱［1］。大白菜为半耐寒性蔬菜，适宜在冷凉的气候中生长。然而，全球气温升高带来的高温会导致叶片生长延迟、发黄和枯萎，严重时会破坏叶球的形成，增加对传染病的易感性，从而降低其质量和产量［2］。

根肿病是由芸薹属根肿菌侵染引起的专性寄生的世界性土传病害，主要为害十字花科作物，它主要侵染植株的根部，致使根部细胞分裂不规则，破坏植物体内水分、养分的吸收和运输，逐渐形成瘤，导致植株萎蔫、矮小、叶片发黄、发育迟缓，严重时导致植株死亡，降低产量［3-5］。近年来，根肿病在全国27个省、市、自治区都有发现，随着大白菜种植面积的增加，根肿病发病面积也随之增大，部分田地上根肿病造成的损失已达50%，使得大白菜产量大幅度下降［6， 7］。有研究表明根肿病的发病与环境条件有关，湿度为60%～80%、中性偏酸的土壤会促进根肿病的发生［8］。夏季高温多雨，尤其是南方地区的土壤普遍偏酸性，更有利于根肿孢子的萌发。抗病育种是从根源防治根肿病的便捷且安全有效的方法。

大白菜是典型的异花授粉植物，有较强的杂种优势。现如今大多采用自交不亲和系和雄性不育系进行制种，在避免浪费人力和物力的同时还能保持育种的纯度，从而降低育种成本。Ogura雄性不育是日本科学家在萝卜中发现的天然雄性不育类型，其花粉完全败育且性状易转移，是十字花科作物中不育性理想的类型［9，10］。为加快育种进程，可将传统育种和现代生物技术结合。Zheng等［11］利用携带CRb基因的大白菜BJN3-2和具有4个子房室、自交亲和且黄色种皮的易感根肿病的大白菜KYS杂交，通过分子标记辅助选择方法进行了自交亲和性、多子房性和根肿病抗性的多基因聚合。徐丽娟等［12］使用秋水仙素将二倍体抗热不结球白菜依伶加倍，获得优质、抗热的四倍体不结球白菜材料。为此，本研究以耐热大白菜、抗根肿病娃娃菜和抗根肿病萝卜胞质不育娃娃菜为材料，通过杂交和分子标记辅助选择、苗期人工气候鉴定的方法，将耐热、抗根肿病、萝卜胞质雄性不育（Ogura CMS）3个性状聚合在一起，以期获得能耐高温环境且抗根肿病的萝卜胞质雄性不育的大白菜材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料由云南省农业科学院园艺作物研究所十字花科课题组提供，包括耐热大白菜CHR21022、抗根肿病娃娃菜CM21026、抗根肿病萝卜胞质雄性不育娃娃菜CM22050，耐热大白菜与抗根肿病娃娃菜为多代自交系；对照材料不抗根肿病且不耐热娃娃菜迷您黄1号、高抗根肿病娃娃菜迷您黄2号、耐热大白菜云夏白5号为云南省农业科学院园艺作物研究所十字花科课题组选育的商品种。

试验于2021年10月至2023年8月在云南省农业科学院园艺作物研究所实验室及梁王山基地进行。

1.2 试验方法

1.2.1 杂交种的获得 将耐热大白菜、抗根肿病娃娃菜种子直播于穴盘中，30 d后移栽至基地栽培，进行常规管理。待两者开花后，在授粉前2 d去除亲本上已经开放的花朵后套袋隔离。授粉时去除母本的雄蕊后将父本的花粉涂抹于雌蕊上，再套袋隔离。收种后进行鉴定。将耐热大白菜、抗根肿病娃娃菜杂交后的种子F1与抗根肿病萝卜胞质雄性不育娃娃菜杂交获得CMSF1。F1自交获得的F2经鉴定筛选后作为父本，CMSF1鉴定筛选后作为母本进行回交，得到BC1。

1.2.2 抗根肿病分子标记筛选 DNA 提取：将抗根肿病娃娃菜CM21026、迷您黄1号、迷您黄2号直播至穴盘中，在幼苗长出2片及以上的真叶时，称取100 mg子叶，使用DNA试剂盒提取DNA，提取后加入1×TE缓冲液稀释，使用超微量分光光度计测定浓度，放入-20 ℃冰箱备用。

PCR 扩增：利用冯希环等［13］、Piao等［ 14］设计的与根肿病抗性基因紧密连锁的分子标记（表1），以不含抗病基因的迷您黄1号和含有抗性基因的迷您黄2号为对照，进行根肿病抗性基因分子标记引物筛选。使用25 μL反应体系进行PCR扩增，反应体系和PCR反应程序参照兰梅等［15］的方法。

PCR 扩增产物检测：完成PCR扩增后，取PCR产物3 μL进行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统上观察、拍照记录，筛选出适合的检测根肿病抗性基因的分子标记。

1.2.3 根肿病抗性的人工接种鉴定 休眠孢子悬浮液的制备：将从云南省昆明市嵩明县根肿病多发地区采集的肿根（经鉴定为4号生理小种）从-20 ℃冰箱中取出，在室温下解冻，剪成小段，加入ddH2O，用榨汁机碎成浆，使用尼龙网过滤，滤液离心后弃上清，取沉淀加入ddH2O调整浓度为1×108个孢子/mL。

根肿菌的接种鉴定：将F1、CMSF1和BC1种子催芽后选取出芽程度一致的种子播于50孔穴盘中（各3穴盘），放入气候培养箱中培养，设置光照12 h/黑暗12 h，湿度65%，温度（25±1） ℃。长至2片真叶时，先控水1 d，再将1 mL浓度为1×107个孢子/mL的根肿菌液用注射法接种，以注射1 mL ddH2O为空白对照，以迷您黄1号、迷您黄2号分别为感病、抗病对照。接种40 d后，参考Zhang等［16］的分级标准统计发病情况。

1.2.4 分子标记鉴定 取F1、CMSF1、BC1幼苗的子叶，提取DNA后利用“1.2.2”筛选出的引物进行PCR扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，观察条带的位置，与迷您黄1号和迷您黄2号进行比对，判断F1、CMSF1、BC1单株是否含根肿病抗性基因。

1.2.5 耐热性鉴定 选取饱满的F1、CMSF1、BC1种子进行催芽，将露白后的种子播于50孔穴盘中，置于（25±1） ℃、光周期16 h光照/8 h黑暗、湿度60%的培养箱中生长。生长25 d后，长至5～6片叶时进行热胁迫处理。将幼苗分为两组，一组在25 ℃（对照）下生长，另一组生长温度为40 ℃/30 ℃（光照/黑暗）。在 40 ℃/30 ℃（光照/黑暗）处理下第0天（CK）、第4天（T-4）、第8天（T-8）、第10天（T-10）时，选取3株生长水平相近的植株对叶片进行取样（3个重复），即幼苗中心处从内向外完全展开的第3、4片叶。叶片取下后立即用液氮冷冻，放至-80 ℃超低温冰箱中备用。

使用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒对过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性进行测定。

1.2.6 萝卜胞质雄性不育鉴定 花器官形态学观察：待植株开花后，选择晴天的上午观察F1、CMSF1、BC1主花序的花器官，取花粉染色观察。

2 结果与分析

2.1 杂交种的获得

以耐热大白菜CHR21022为母本，抗根肿病娃娃菜CM21026为父本，进行人工授粉杂交，得到杂种F1；将F1和抗根肿病萝卜胞质雄性不育娃娃菜CM22050杂交后获得CMSF1；同时F1进行自交后得到F2，进行鉴定筛选后的CMSF1和F2回交得到BC1，同时F2进行自交得到F3。如图 1所示，F1种子的颜色表现出和母本相同的黄色，CMSF1为黑色，BC1表现出黑褐色，F2和F3种子呈现出黄褐色。如图 2所示，CHR21022和CM21026杂交的角果细长、饱满、尖端果喙长，F1和CM22050杂交后的角果短、饱满、果喙较短，回交后的角果大部分呈现细长和果喙长的形态。

2.2 抗根肿病分子标记筛选结果

迷您黄1号、迷您黄2号和CM21026的DNA提取完成后，利用5对合成的根肿病相关抗性基因连锁的分子标记引物进行引物筛选，琼脂糖凝胶电泳结果如图 3所示。使用引物crb-1扩增时，迷您黄1号未扩增出特异性条带，迷您黄2号、CM21026扩增出特异性条带，且条带大小在400 bp左右；使用引物crb-2、crb-4、crb-5扩增时，迷您黄1号、迷您黄2号和CM21026均出现条带；使用引物crb-3扩增时，均未扩增出明显的条带。综上表明，引物crb-1适用于后续试验中根肿病抗性基因的检测。

2.3 根肿病接种鉴定结果

以迷您黄1号为感病对照，迷您黄2号为抗病对照，对杂种后代F1和CMSF1、BC1进行接种鉴定，部分结果如图 4所示。接种浓度为1×107个孢子/mL的根肿菌液后，迷您黄1号、迷您黄2号和杂种后代F1、CMSF1、BC1均出现发病株，迷您黄1号发病植株中3级病株较多，多表现为主根肿大，出现龟裂现象，且中心生长点短缩，新生叶片无法生长。病情指数统计结果如表2所示，迷您黄1号表现为感病，迷您黄2号、F1、CMSF1、BC1均表现为抗病。

2.4 根肿病抗性基因分子标记鉴定结果

用筛选出的引物crb-1对F1、CMSF1和BC1进行分子标记鉴定。部分结果如图 5所示，对照迷您黄1号未出现条带，对照迷您黄2号和F1单株均扩增出400 bp左右的特异性条带，表明所鉴定的F1单株均携带根肿病抗性基因。如图6所示，所鉴定的CMSF1群体中，有26株未扩增出特异性条带，不含根肿病抗性基因，124株扩增出400 bp左右的特异性条带，含有根肿病抗性基因。BC1群体的部分鉴定结果如图7所示，BC1有104株扩增出特异性条带，含有根肿病抗性基因。

2.5 耐热鉴定结果

对F1、CMSF1、BC1幼苗进行热胁迫，结果如图 8所示，热胁迫第4天时，相对于热胁迫0 d其形态没有明显变化；在热胁迫8 d和10 d后，叶片颜色均开始呈现为黄绿色，迷您黄1号在热胁迫8 d后茎基部第一片叶开始枯萎，耐热对照云夏白5号叶柄伸长；热胁迫第10天，迷您黄1号新叶生长缓慢，长势变弱，云夏白5号、F1、BC1叶片开始向下卷缩。

如图9所示，在热胁迫条件下，迷您黄1号的CAT活性表现出和POD活性相似的变化，云夏白5号的CAT活性随着热胁迫时间的延长呈现明显的上升趋势，F1、CMSF1相对于CK表现出增加的趋势，在第8天时达到最高，BC1的CAT活性在第10天时最高。迷您黄1号和云夏白5号、F1、CMSF1以及BC1的POD活性总体上变化不明显，F1、CMSF1呈现缓慢上升的趋势。SOD活性的变化趋势较为复杂，总体上，云夏白5号在4个材料中SOD活性最高，迷您黄1号相对CK均为下降，F1表现出上升趋势，CMSF1受到热胁迫后先下降，在第4 天后表现为增加，BC1在热胁迫第8天时活性开始升高。

2.6 杂种后代萝卜胞质雄性不育鉴定结果

如图10所示，观察F1、CMSF1和BC1的花器官发现，花色均为黄色，F1雄蕊略高于雌蕊，花丝相对较长，花药形态饱满，有大量花粉；CMSF1和BC1雄蕊较低，花丝短，花药退化、干瘪，未见花粉，可见明显的雄蕊败育。

3 小结与讨论

将不同个体的优良性状通过杂交育种的方式组合到一起，是较为基础的育种方法，通过分子标记等技术可以更准确和快速地筛选植株，减少育种年限。

本研究通过杂交及回交方式将耐热、抗根肿病和萝卜胞质雄性不育的性状聚合在同一材料中，采用分子标记检测F1植株均含有根肿病抗性基因，CMSF1单株少部分不含有根肿病抗性基因。室内苗期人工接种107个孢子/mL的根肿菌液后，F1和CMSF1病情指数显示为抗病，但均存在少部分植株发病的情况。罗延青等［17］的研究中也出现类似的情况，抗根肿病白菜康根51在室内接种鉴定时少数植株出现轻微发病情况，但是在根肿病发病区域种植有较好的根肿病抗性，猜测可能存在杂合体单株抗性相对较弱情况。有研究发现，根肿病发病区域的根肿病菌含量介于104～106个孢子/g土壤，103个孢子/g土壤是根肿病发生的阈值，浓度大于104个孢子/g土壤时则该地区发病明显［18-20］。实验室根肿菌的接种浓度普遍大于自然土壤中根肿菌的浓度，因此在实验室接种后发病，田间种植却可能表现良好的根肿病抗性。

高温胁迫下，植物体内会产生一系列生理生化反应，前人因此采用种子活力鉴定法、人工模拟高温鉴定法、实验室间接鉴定等来判断植物是否具有耐热性［21-24］。高温使大白菜产生大量的活性氧，导致膜产生变化，对植株产生损伤，使大白菜植株产生热害症状，而SOD、POD、CAT等清除活性氧，从而减缓损伤［25，26］。有研究发现，耐热性强的植株的症状更轻，POD、SOD、CAT等也作为评价耐热性的生理指标［27-29］。

本试验采用人工模拟高温在苗期进行热胁迫，结果表明，随着热胁迫时间的延长，植株出现热害症状，F1、CMSF1和BC1的症状较轻，与前人研究一致。本试验测定了高温胁迫下不同时间的SOD、POD、CAT活性，结果表明，F1、CMSF1的CAT活性呈现先升后降，BC1的变化出现了起伏，F1、CMSF1和BC1的POD活性随着热胁迫时间的增加而升高，F1的SOD活性升高，CMSF1降低后升高；BC1缓慢增加。总的来看，F1、CMSF1和BC1的SOD、POD、CAT活性增幅大于不耐热品种迷您黄1号的现象与白晨熙［30］和陈以博等［31］试验中耐热品种活性增幅大于热敏品种的结果相似。

Ogura胞质雄性不育是十字花科作物杂种优势利用的重要途径。李崇娟等［32］利用远缘杂交将芥菜的B基因组导入白菜，通过回交和胚挽救技术创制的Ogura 胞质雄性不育芥菜材料雄蕊彻底败育，已完全退化为花瓣状。在本试验中，杂交后获得的CMSF1和BC1植株经过花器官观察其雄蕊与崔辉梅等［33］的研究结果一致，雄蕊败育，花药干瘪无花粉，为Ogura胞质雄性不育株。

本试验通过杂交结合分子标记和表型鉴定以及耐热性鉴定，获得了耐热、抗根肿病和萝卜胞质雄性不育多个性状聚合的大白菜材料，为后续多性状优良大白菜的育种提供了材料。

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