红花龙胆的组织培养研究

摘 要：为建立红花龙胆的组培快繁体系，对外植体的选择、消毒方法、无菌系的建立、继代培养、生根培养、组培苗的壮苗及移栽等进行研究。结果显示：红花龙胆的组织培养最合适的外植体是茎尖，初代培养选择75%的酒精和0.1% HgCl2消毒，污染率最低，效果最佳；诱导培养基选择MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂0.5%；继代培养基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂0.5%+活性炭0.2%～0.3%；生根培养基为1/2MS+NAA 0.5 mg/L

+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂0.5%+活性炭0.2%～0.3%；珍珠岩∶蛭石∶腐殖土为1∶1∶1作为移栽基质，其移栽成活率达90%以上。

关键词：红花龙胆；组织培养；外植体

中图分类号：S435.672 文献标志码：B 文章编号：2095–3305（2024）10–00-03

红花龙胆又叫龙胆草、土白莲、九月花、星秀花、冷风吹和雪里梅，属于龙胆科[1]。红花龙胆味苦、性寒，属于寒性中药。全草入药，具有清热除湿、解毒、止咳的功效，能治湿热黄疸、肺热咳嗽、小便不利等症。

当前关于红花龙胆的研究很多，在红花龙胆血清药物化学、红花龙胆的栽培、化学成分、资源调查、显微鉴别、生药学鉴定等方面均有研究，在组织培养方面有红花龙胆愈伤组织诱导研究、红花龙胆组培快繁体系研究[2-10]。野生红花龙胆由于受自然环境和生长条件的限制，产量较低，加之民间人为采挖比较严重，导致资源不断减少[11-16]。对此，为进行种源保护，对红花龙胆的组织培养进行研究具有重要意义。

1 材料来源

红花龙胆外植体是从贵州省兴义丰都和白碗窑、兴仁大山、安龙笃山等地采集。采集点远离公路和村寨，采集到的外植体受污染程度较小。

2 外植体的采集

2.1 外植体的采集时间

红花龙胆的外植体在3—8月均可进行采集，最佳采集时间为4—5月。这期间采集的红花龙胆幼嫩，生理机能旺盛，容易消毒灭菌和培养，分化率高。8月后采集的红花龙胆，已进入生长末期，对诱导培养的反应迟钝，诱导时间过长，或者不分化。值得注意的是，采集红花龙胆的外植体尽量不要在雨天取材，这样灭菌比较困难，污染率高，采集应在雨后晴天的早晨进行。

2.2 外植体的采集部位

取红花龙胆带侧芽的幼嫩茎段、茎尖作外植体，茎尖的生长速度快，培养5～10 d后开始生长，幼嫩茎段的侧芽容易萌发，且有稳定的遗传性状。

3 培养基的选择和培养条件

诱导培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

30 g/L蔗糖+0.5%琼脂；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂。

继代培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

IBA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂+0.2%～0.3%活性炭；

生根培养基：1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L

+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂+0.2%～0.3%活性炭。

诱导、继代、生根培养都选择MS培养基，细胞分裂素用6-BA，浓度为1.5 mg/Ｌ，生长素选择NAA和IBA，蔗糖提供碳源和调节培养基的渗透压，琼脂作为支持物，活性炭吸附有毒副作用的物质。

配制好的培养基在121 ℃条件下灭菌20～30 min，

接种后置于培养室中，光照强度为1 000～2 000 Ix，培养温度为（25±1）℃，空气湿度保持在80%以上进行培养。

4 培养方法

4.1 外植体的消毒灭菌及无菌系的建立

外植体的消毒灭菌主要采用以下两种方法：一种是将受污染程度较小的红花龙胆幼嫩茎段、茎尖用矿泉水浸泡30 min～2 h，用70%～75%的酒精消毒15～18 s，

再用无菌水洗涤3～4次，0.1%的氯化汞（HgCl2）消毒15～18 min，继续用无菌水洗涤3～5次；另一种是用5%的次氯酸钠取代0.1% HgCl2消毒灭菌15～20 min，无菌水洗涤3～4次。

将消毒灭菌后的茎切成0.5～1 cm的小段，每段至少有1个侧芽，茎尖切成0.5 cm的小段接种到诱导培养基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂上进行培养，使用MS+6-BA 1.5 mg/L+

NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂作为诱导培养基，茎尖作为外植体，5～10 d后侧芽和顶芽开始生长。待35 d后长出1～4个侧芽，茎长为3～5 cm，2个月后转接到继代培养基上进行继代培养。使用MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂作为诱导培养基，茎尖作为外植体，15 d后侧芽和顶芽开始生长。待45 d后长出1～2个侧芽，茎长长至2～4 cm，2个半月后转接到继代培养基上进行继代培养。

4.1.1 初代培养的污染率

两种方式处理不同外植体的污染率的具体情况见表1、表2。

初代培养的消毒灭菌处理分析：由表1和表2中的数据可以看出，采用0.1% HgCl2处理不同外植体接种的污染率明显低于采用5% 次氯酸钠处理不同外植体接种的污染率，因此采用0.1% HgCl2处理的效果较好。但其缺点是汞离子不易去除，必须多次用无菌水冲洗，并且剧毒的HgCl2在自然中和在人体内都不会降解，使用时要小心谨慎，使用后的消毒剂废液及洗涤外植体的废水要做回收处理，避免对环境造成污染[17]。

表1" 采用0.1% HgCl2处理不同外植体接种的污染率

外植体 接种数/株 污染数/株 污染率/%

带侧芽茎段 40 18 45.00

茎尖 28 5 17.86

表2" 采用5% 次氯酸钠处理不同外植体接种的污染率

外植体 接种数/株 污染数/株 污染率/%

带侧芽茎段 21 18 85.71

茎尖 10 3 30.00

4.1.2 初代培养的分化率

在采用0.1% HgCl2处理情况下，两种培养基接种外植体分化率的具体情况见表3、4。

由表3和表4可以看出，采用茎尖作为外植体时，

在培养基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+

0.5%琼脂中的分化率为71.43%，在培养基MS+6-BA

2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂中的分化率为60.00%，使用MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

30 g/L蔗糖+0.5%琼脂作为初代培养基效果较好。采用

带侧芽茎段作为外植体时，在培养基MS+6-BA 1.5 mg/L+

NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂中的分化率为5.00%，

在培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+

0.5%琼脂中的分化率为14.29%，使用MS+6-BA 2.0 mg/L+

NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂作为初代培养基效果较好。此外，无论是采用MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA

0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂培养基，还是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂培养基，茎尖的分化率都比带侧芽茎段的分化率高，因此在红花龙胆的组织培养中，茎尖是最佳的外植体。

表3" 培养基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

30 g/L蔗糖+0.5%琼脂的分化率

外植体 接种数/株 分化数/株 分化率/%

带侧芽茎段 40 2 5.00

茎尖 28 20 71.43

表4" 培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+

30 g/L蔗糖+0.5%琼脂的分化率

外植体 接种数/株 分化数/株 分化率/%

带侧芽茎段 21 3 14.29

茎尖 10 6 60.00

4.1.3 初代培养消毒灭菌处理时间的控制

根据表5和表6中的数据对比发现，应严格控制对红花龙胆外植体的消毒灭菌时间。消毒时间过短，初代培养容易造成污染，污染率高；消毒时间过长，消毒剂容易使红花龙胆的组织造成损伤，甚至死亡，死亡率高。从表5和表6中可知，75% 酒精对红花龙胆消毒的最佳时间为15～18 s，0.1% HgCl2对红花龙胆消毒的最佳时间为15～18 min。

表5" 采用75% 酒精和0.1% HgCl2处理茎尖，不同消毒灭菌时间的死亡率

75%酒精消毒时间/s 0.1% HgCl2消毒时/min 接种数/株 死亡数/株 死亡率/%

10～12 12 37 0 0.00

15～18 15 28 3 10.71

15～18 18 32 4 12.50

20 20 60 20 33.33

表6" 采用75% 酒精和0.1% HgCl2处理茎尖，不同消毒灭菌时间的污染率

75%酒精消毒时间/s 0.1% HgCl2消毒时间/min 接种数/株 污染数/株 污染率/%

10～12 12 37 23 63.16

15～18 15 28 5 17.86

15～18 18 32 3 9.38

20 20 60 2 3.33

4.2 继代培养

待初代培养中侧芽和顶芽长至3～5 cm时，转接到继代培养基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂+0.2%～0.3%活性炭上，进行继代培养，45 d为一个周期转接一次。

在红花龙胆的继代培养过程中，会出现褐变现象。而茎尖和幼嫩茎段褐变程度较低，因此在继代培养中应选择茎尖和幼嫩茎段继续培养。此外，在培养基中添加0.2%～0.3%的活性炭可以有效避免酚类物质被氧化产生醌类物质的毒害作用，防止褐化。

在红花龙胆的继代培养中，仍然会出现乳白色的细菌污染，菌斑呈黏液状，接种2～3 d开始出现，因此要进行防治。对培养基要进行彻底灭菌，先排净高压锅里面的冷空气，然后升温至121 ℃，灭菌20～30 min；接种操作器械也要进行彻底灭菌，镊子、接种环等接种工具每使用一次都要在酒精灯上进行灼烧灭菌；操作人员在接种过程中禁止讲话、打喷嚏，要注意呼吸，操作要规范熟练；培养瓶和盖要定期检查，瓶和盖有损坏要立即更换；被细菌污染的培养基，对培养基进行高压灭菌后再进行清洗，防止交叉污染。

4.3 生根培养

待继代培养中苗长到5～8 cm时，将生长健壮的苗从继代培养基中转接生根培养基1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂+0.2%～0.3%活性炭中进行生根，生长不健壮的苗继续转接到继代培养基中进行继代培养，生根培养的温度为25～27 ℃，

光照强度为1 000 lx，光照时间8～10 h/d，培养15 d后，

待根长为1～2 cm时，取出茎苗，洗净基部的培养基，进行移栽。

5 炼苗移栽和田间管理

生根培养15～30 d后，组培苗根长到1～2 cm时，打开瓶盖，在培养基上加薄层水，移至大棚中培养5～7 d，取出组培苗移栽到珍珠岩∶蛭石∶腐殖土为1∶1∶1的基质中，在基质中可以适当加入一些农家肥。取苗时要用镊子小心操作，切勿将根系损坏，清洗黏附在根系上的琼脂，动作要轻，减少或避免伤根伤苗。移栽时用小铲或粗的竹签在基质中开穴，然后再种植红花龙胆组培苗，使根舒展开。移栽后3～5 d浇1次水，移栽初期保持空气湿度为90%以上，温度保持20～25 ℃。移栽后要注意防治红花龙胆的根腐病，在移栽前使用甲霜恶霉灵稀释成1 500～2 000倍液浸泡或者移栽后使用甲霜恶霉灵稀释成1 500～2 000倍液喷施叶面可以进行有效防治。

6 结论

在红花龙胆的组织培养中，初代培养的培养基选择MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖+

0.5%琼脂效果较好，外植体采用茎尖，外植体的消毒灭菌采用的方法是用矿泉水浸泡30 min～2 h，70%～75%的酒

精消毒15～18 s，再用无菌水洗涤3～4次，0.1% HgCl2消毒15～18 min，继续用无菌水洗涤3～5次，污染率最低。

继代培养选择培养基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+0.5%琼脂+0.2%～

0.3%活性炭，继代效果较好。

生根培养选择培养基为1/2MS+NAA 0.5mg/L+

IBA 0.2 mg/L+30g/L蔗糖+0.5%琼脂+0.2%～0.3%活性炭，生根效果较好。

移栽后的田间管理要防止红花龙胆的根腐病，移栽前可使用甲霜恶霉灵稀释成1 500～2 000倍液浸泡根部，以防治根腐病。

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收稿日期：2024-08-15

基金项目：黔西南州科技计划项目“民族药倒提壶总生物碱提取工艺优化及安全性评价”（2023－1－18）。

作者简介：曾镇广（1971—），男，贵州兴义人，副教授，研究方向为分析化学、药物分析、药用植物组织培养。