贝莱斯芽孢杆菌对桃采后软腐病的防治及对果实诱导抗性的影响

摘要：为明确贝莱斯芽孢杆菌Q-84对桃果实软腐病的生防效果，本试验以“映霜红”桃为材料，研究Q-84菌悬液对桃采后软腐病的抑制效果及对果实品质的影响，并对果实过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、几丁质酶（CHI）和脂氧合酶（LOX）4种防御相关酶活性进行测定。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌Q-84菌悬液处理可显著抑制桃果实软腐病，抑制果实LOX活性，诱导POD、PAL、CHI活性增加，提高果实抗病和抗氧化能力，减缓桃硬度下降，对桃果实色泽及可溶性固形物和可滴定酸含量无不良影响。表明贝莱斯芽孢杆菌对桃果实软腐病具有较好的防治效果，在桃果实采后生物防腐保鲜领域具有重要应用价值。

关键词：贝莱斯芽孢杆菌：匍枝根霉；桃：酶活性；果实品质；生物防治

中图分类号：S436.629 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024） 10-0141-07

桃（Prunus persica L．）属蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus L．）桃亚属（Amygdalus）多年生落叶果树，原产于中国。我国是桃栽培品种最多的国家，品种数量占全世界2/3以上。2019年我国桃种植面积和产量分别为89.0万hm2和1 599.3万t，均居世界第1位。桃果实皮薄质软，易受到机械损伤，加上成熟期在高温季节，极易遭受病原菌的侵染而腐败变质。

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）是接合菌门中最常见也是生长速度最快的物种之一，是一种强寄生病原真菌，主要通过伤口感染果实，一旦侵入寄主便会迅速蔓延。感病果实起初形成浅褐色、形状不规律的病斑，然后迅速扩展，长出白色或灰白色的菌丝体，继而产生暗褐色或黑色的孢子囊，其内的孢子可经气流传播。匍枝根霉是引起甜樱桃果实采后软腐病的主要病原真菌之一，研究发现嘧菌酯、异菌脲和二氧化氯等化学杀菌剂可降低桃和芒果软腐病的发病率。但过量使用化学杀菌剂不仅会使病原菌菌株产生抗药性，而且会对人体健康产生不利影响。生物防治作为一种无毒、绿色、安全、无抗药性的保鲜方法，已经成为国内外研究的热点。

芽孢杆菌是一种广泛存在于自然界中的细菌，具有广谱抑菌性、繁殖速度快、抗逆性强、安全性高等优势，是一类理想的生防菌。芽孢杆菌防治果蔬采后病害，不仅可以直接合成抗菌活性代谢产物，也间接启动多个防御反应机制。研究发现，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）对匍枝根霉具有显著的拮抗作用，且能诱导果蔬产生抗病性。多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）是存在于植物体内可以抵抗病原菌侵染的防御相关酶。PPO通过催化木质素及醌类化合物的合成，构成保护性屏障来抵御病原入侵：POD催化H2O2分解为水，消除氧自由基，解除H2O2对果实的毒害，提高果实抗逆性：PAL是第一个丙苯烷代谢的关键酶，能够氧化酚类物质产生能限制或杀死病原微生物的有毒醌类物质。脂氧合酶（LOX）是催化细胞膜脂肪酸氧化反应的酶，其代谢途径的产物主要参与膜脂过氧化作用，增加细胞膜透性，加剧细胞膜降解，进而生成脂质氢过氧化物等毒害物质。

贝莱斯芽孢杆菌Q-84是本课题组从甜樱桃中筛选出的一株对匍枝根霉有较好抑制效果的拮抗菌。本研究通过测定贝莱斯芽孢杆菌对‘映霜红’桃果实采后软腐病的抑制效果以及对果实品质的影响，并通过分析POD、PAL、CHI、LOX酶活性的变化情况，探讨贝莱斯芽孢杆菌Q-84对桃果实相关防御酶活性的影响，以期为桃果实采后软腐病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试桃品种为“映霜红”。鲜果于2022年10月下旬采自山东省淄博市沂源县，采后立即运回实验室，并挑选成熟度一致、大小均匀、无机械伤和病虫害的果实用于本试验。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Q-84菌株由山东省果树研究所提供。将斜面保存的菌株接种到LB固体培养基活化24 h，活化后接于50mL LB液体培养基中，37℃、180 r/min条件下振荡培养24 h，5 000 r/min下离心10 min，用无菌水将离心好的菌体重新悬浮，调整细胞浓度为所需浓度。

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）由山东省果树研究所提供。将斜面保存的菌株于PDA培养基上28℃活化48 h，无菌水冲洗菌丝和孢子，用灭菌手术刀将菌丝和孢子刮下置于锥形瓶内，加人数粒玻璃珠，28℃、180 r/min条件下振摇30min，四层无菌的纱布过滤菌丝，血球计数法计数，调整到104 cfu/mL孢子悬浮液待用。

1.2 试验方法

1.2.1 贝莱斯芽孢杆菌对桃果实腐烂率、病情指数及抗性相关酶活性的影响

挑选成熟度一致、大小均匀、无机械损伤和病虫害的桃果实，用100mg/L的次氯酸钠对果实表面消毒，无菌水冲洗并自然晾干后，在果实赤道部刺一个3 mm × 3 mm的伤口，分为5组进行处理。CK组：接入20 μL无菌水；R. stolonifer组：4 h后在伤口处接种104cfu/mL的匍枝根霉孢子悬浮液10 μL；Q-84+R.stolonifer组：接人108 cfu／mL的贝莱斯芽孢杆菌菌悬液20 μL，4h后在伤口处接种104 cfu/mL的匍枝根霉孢子悬浮液10 μL；纳他霉素+R. stoloni-fer组：接人100mg/L的纳他霉素20 μL，4h后在伤口处接种104 cfu/mL的匍枝根霉孢子悬浮液10 μL；Q-84组：接人108 cfu/mL贝莱斯芽孢杆菌菌悬液20 μL。处理后果实放置于塑料筐中密封，筐内相对湿度达90%，CK、R．stolonifer、Q-84+及．stolonifer、纳他霉素+R. stolonifer 4组在28℃下每12 h观察发病情况，并测定果实病斑直径和病情指数。每处理30个果实（n=3），重复2次。CK、R．stolonifer、Q-84+R. stolonifer、Q-84组分别于处理后0、24、48、72、96 h取样测定果实酶活性。每处理50个果实（n=3），每次测定取8个果实，重复2次。

1.2.2 贝莱斯芽孢杆菌菌悬液浸泡对桃果实采后软腐病的防治和贮藏品质的影响

挑选大小和成熟度一致的健康桃果实，100 mg/L次氯酸钠溶液消毒、无菌水冲洗晾干后分3组进行处理。CK组：无菌水浸泡1 min后捞出晾干；Q-84组：108cfu/mL贝莱斯芽孢杆菌菌悬液浸泡1 min后捞出晾干；纳他霉素组：100 mg/L纳他霉素浸泡1 min后捞出晾干。各组果实处理4h后均无伤接种104 cfu/mL的匍枝根霉孢子悬浮液，放置于相对湿度为95%的塑料筐中，28℃下每3d统计发病情况并测定果实品质相关指标。每处理20个果实（n=3），重复2次。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 腐烂率和病情指数

果实腐烂率（%）=桃烂果总数／桃果实总数×100：

果实病情指数（%）=∑[（腐烂的级别×该级桃果实的数量）／（最高的腐烂级别×桃果实的总数）]×100。

根据腐烂情况将果实的病情指数分为5个级别，即0级：无明显病斑：1级：10%病斑；2级：10% - 20%病斑：3级：20% -40%病斑：4级：＞40%病斑。

1.3.2 相关酶活性测定

POD活性参考Yang等的方法，采用愈创木酚法测定：脂氧合酶（LOX）活性参照孟坤的方法测定；PAL活性参照Khumalo等的方法测定；几丁质酶（CHI）活性参照Samarah等的方法测定。以上方法根据实际测定略有改动。

1.3.3 相关品质指标测定

色泽：在果实缝合线两侧赤道部对称取2个点，用色差仪（3nh，NRIOQC型）测定a*值和L*值。硬度参照标准NY/T 2009-2011测定。可溶性固形物含量参照标准NY/T 2637-2014测定。可滴定酸含量采用酸碱中和滴定法测定。每个样品重复测定3次，取平均值。

1.4 数据处理与分析

数据采用Microsoft Excel 2010、Origin 8.0软件进行统计与作图，并用SPSS 16.0软件进行ANOVA邓肯氏差异分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 贝莱斯芽孢杆菌对桃果实采后软腐病的防治效果

2.1.1 对桃果实腐烂率及病情指数的影响

图1为处理12、24、36、48、60 h时，果实发病率、病斑直径和病情指数的调查分析结果，表明，用拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理后对采后桃的软腐病具有明显的防治效果。R．stolonifer组接种后24 h果实开始发病，48 h果实全部腐烂；而Q- 84+R.stolonifer组接种后48 h开始发病，至60 h时发病率仅为23.7%。从病斑直径看，Q-84+R. stolonifer组显著低于R．stolonifer组和纳他霉素+R. stoloni-fer组。接种后48 h，R．stolonifer组病情指数最高，为76.79%，Q-84+R. stolonifer组和纳他霉素+及．stolonifer组病情指数分别为5.3%、6.7%；接种后60 h，R．stolonifer组病情指数达90.91%，Q-84+及．stolonifer组和纳他霉素+R. stolonifer组分别为8.1%和14.6%。

2.1.2 对桃果实抗性相关酶活性的影响

从图2可以看出，贮藏期间Q-84组和Q-84+R. stoloni-fer组POD活性呈现先升高后降低的趋势，CK组变化平缓。接种后36 h，各组POD活性均达到峰值，Q-84和Q-84+R. stolonifer组酶活性分别为438 U/g和412 U/g，为CK的1.43倍和1.35倍，且显著高于R．stolonife组。接种36 h后，各组POD活性呈下降趋势，Q-84和Q-84+R. stoloni-fer组始终显著高于其他两组，且在接种后60 h，Q-84酶活性为CK的1.09倍。这表明接种拮抗菌Bacillus velezensis能显著增加POD活性，提高其抗病抗氧化能力。

R．stolonifer和Q-84+R. stolonifer组LOX活性均呈现先升高后降低的趋势，Q-84组和CK组变化则较为平缓。只接种病原菌处理组在接种后12-24 h酶活性迅速增加，于36 h达到峰值，LOX活性为52.12 U/g，是对照组的1.27倍；接种拮抗加病原处理组酶活性为46.7 U/g，与对照组差异显著。接种36 h后各处理组LOX活性有所降低，但病原菌处理组一直保持较高活性；60 h时，病原菌组LOX活性仍能达到对照组的1.21倍。从图中可以明显看出，拮抗菌Q-84+R. stolonifer组的酶活性显著低于病原菌组，表明，接种拮抗菌B．velezensis可以抑制由匍枝根霉引起的桃果实LOX活性，减轻自由基对细胞膜的破坏程度，保持细胞完整性。

各处理组PAL活性均呈现先升高后降低的趋势，对照组变化平缓。接种后0- 36 h，各处理组PAL活性迅速上升，均于36 h达到高峰，其中Q-84+R. stolonifer、Q-84、R．stolonifer组PAL活性分别为25.14、22.40、20.46 U/g，分别为CK的1.43、1.27、1.16倍。整个处理期间，病原菌处理组酶活性都处于相对较低的水平，显著低于Q-84+R. stolonifer和Q- 84组。接种Q- 84+及．stolonifer以及只接种Q- 84均能诱导PAL活性，说明B．velezensis处理能够进一步提高桃果实中的PAL活性，增强果实对病原菌的抵抗能力，且病原菌R．stolonifer可以促进其诱导作用。

对照组CHI活性在整个处理期间都处于较低水平，各处理组CHI活性均呈先上升后下降的趋势，且显著高于对照组（P＜0.05）。0-12 h，各处理酶活性快速升高，均在接种后36 h达到峰值，其中Q-84+R. stolonifer、Q-84、R．stolonifer组CHI活性分别为28.50、26.93、23.03 U/g，为CK的1.37、1.29、1.11倍。36 h之后，Q-84+R. stolonifer组和Q-84组CHI活性有所降低，但都保持较高活性。60 h时，Q-84+R. stolonifer组和Q-84组的CHI活性分别为22.84 U/g和22.34 U/g，分别是对照组的1.29、1.26倍。表明拮抗菌B．velezensis处理能诱导桃果实CHI活性，提高果实抗病性。

2.2 贝莱斯芽孢杆菌浸泡对桃果实采后软腐病防治及贮藏品质的影响

2.2.1 对桃果实腐烂率的影响

从图3和图4可以看出，在贮藏过程中，Q-84菌悬液处理的桃果实发病率一直低于对照组；处理后8d，CK组发病率为83.2%，纳他霉素组发病率为27.3%，而Q-84组发病率仅为24.3%。这说明，Q-84菌悬液浸泡处理可以显著抑制软腐病的发生，效果与纳他霉素相当。

2.2.2 对桃果实贮藏品质的影响

从图5可以看出，桃果实在贮藏8d后，CK组的硬度从10.3N下降到3.95 N，而Q-84组的硬度从10.3 N F降到4.26 N，组间差异不明显，表明Q-84对桃果实硬度的影响较小。Q-84处理对桃果实色泽无显著影响，Q-84组和CK的L*值均呈现先升后降的趋势，至贮藏后8d，CK和Q-84组的L*值分别降至63.9和64.86;a*值随处理时间延长呈上升趋势，至8d时CK和Q-84组a*值分别达14.29和13. 87，各处理时间两组间差异不明显。可溶性固形物和可滴定酸含量均随贮藏时间的延长呈下降趋势，Q-84组与CK差异不明显，表明Q-84菌悬液处理对桃果实可溶性固形物和可滴定酸含量无不良影响。

3 讨论与结论

当植物受到病原微生物侵染时体内的防御保护酶活性会被诱导，从而提高植株的抗病能力。Jayapala等研究表明，芽孢杆菌BSp.3/aM通过增强防御相关酶的活性、增加酚类化合物的积累来诱导果实对入侵病原体的抗性：防御相关酶（PAL、POX、PPO、LOX和CHI）活性与炭疽病发病率也有密切的关联。单独施用枯草芽孢杆菌或与植物营养素（NPK和Zn2+）联合使用，可以提高番茄植株总酚含量和PAL、SOD、CAT、POD、PPO等防御酶的活性，进而帮助植株抵御微生物的侵害，有效控制病害，改善植物生长特性。本研究也证明了拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌Q-84可诱导果实抗病性：经菌悬液处理的桃果实，其POD、PAL、CHI活性都显著高于对照，LOX活性显著低于对照，表明果实在遭受病原菌侵染后可通过诱导抗性相关酶的表达诱导系统产生抗性，从而增强果实抗病性。胡欣洁等研究发现，用枯草芽孢杆菌菌悬液处理猕猴桃果实，有效延缓了果实硬度的下降，可滴定酸含量呈下降趋势。

综上所述，贝莱斯芽孢杆菌Q- 84菌悬液可有效防治桃采后软腐病，通过诱导增强防御相关酶POD、PAL、CHI活性和抑制LOX活性，来提高果实的抗病能力，延缓果实硬度的下降，且对果实品质无负面影响。这说明该拮抗菌可安全、有效防治桃软腐病，具有重要的研究价值。

基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2021MC183）；山东省果品产业技术体系项目（SDAID-06-13）；山东省农业科学院农业科技创 新工程项目（CXGC2024D20）：山东省重点研发计划项目（2021CXGC010809）