59份苜蓿种质种子表型性状遗传多样性分析及评价

摘要：本研究选取59份来源不同的苜蓿种质种子为试材，分析不同种质问种子表型性状的遗传变异，基于数字图像系统得出并分析其种子长、种子宽、长宽比、种子周长、种子形状系数、百粒重和种子厚共7个种子形态指标，进而结合种子形态指标评估不同种质种子表型性状的基因型方差分量、表型方差分量、基因型方差系数、表型方差系数、广义遗传力和遗传增益。结果表明，59份苜蓿种质问的种子表型性状均存在极显著差异（P＜0．01），表型性状的变异系数在1. 87% - 35. 18%之间。各种子表型性状中，百粒重的表型方差系数（PCV）、基因型方差系数（GCV）值均最大，百粒重和种子厚的广义遗传力（H2b）分别位于第一和第二位。各表型性状之间存在显著相关性（P＜0.05）。通过聚类热图分析看出，当欧式距离为50时，59份苜蓿种质可分成三大类群。结合遗传力和遗传增益对59份苜蓿种质进行综合评价，综合性状优良种质的编号分别为712（WL712）、440（WLA40HQ）、5（维多利亚）、28、801（巨能801）、525（WL525HQ）和21（无棣苜蓿）。综上，59份苜蓿种质种子具有丰富的遗传多样性。本研究结果可为苜蓿种质种子性状改良、选种育种提供一定理论依据。

关键词：苜蓿；种子性状；表型变异；遗传力；综合评价

中图分类号：S541.9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）10-0034-09

苜蓿（Medicago sativa L．）是全球广泛栽培的豆科牧草，在我国主要分布于西北五省及西藏、内蒙古等地区，西南贵州海拔1 000 -1 800m的地区也有少量分布。紫花苜蓿、黄花苜蓿和杂交苜蓿等是几种常见的苜蓿属植物。紫花苜蓿（M. sativa）是多年生豆科牧草，具有分布广、适应性强和经济价值高等众多优点，被誉为“牧草之王”和“绿色黄金”。黄花苜蓿（M.falcata）是紫花苜蓿的近缘野生种，具有抗逆性强、营养品质高等特点，广泛种植于自然条件较恶劣的地区。杂交苜蓿又名杂花苜蓿，是由紫花苜蓿、胶质苜蓿（M. glutinosa）和黄花苜蓿杂交产生的复合体，该物种携带有大量的遗传变异基因，兼具亲本的许多优良性状，是研究遗传多样性的优良植物。苜蓿种子表型性状多样性是种质资源遗传多样性研究的重要组成部分，但以往对其的研究相对较少。

植物种子表型性状作为重要的经济性状，是物种遗传多样性的重要基础，而种子形态对生产中的产量获得起到重要作用。种子性状包括大小、质量等，在植物野生种源开发、选种育种等方面有广泛的研究价值。种子与植物其他器官相比，具有形态更稳定、易收集、储存时间长等诸多优点，此外，种子大小与幼苗发芽特性、生长速度、存活率以及植物发育过程密切相关，对种群更新和其环境适应性都有重要意义。李鸿雁等研究表明，不同生态型扁蓿豆种子性状之间存在显著差异，具有丰富的遗传多样性。陆忠杰等通过分析75份箭筈豌豆（Vicia sativa L．）种子形态遗传多样性，筛选出4个对遗传改良具有重要意义的特殊种质。由此看出，对种子表型遗传变异进行分析显得尤为重要，关于种子形态研究已日益受到研究者的重视。WinFOLIA 2014是一种专门用于分析植物叶片和种子表型的数字图像分析系统，与传统的人工测量法相比，该系统配置光学扫描仪，能够产生没有误差的高分辨率数字图像，进而更加精确地自动检测并分析植物种子的多项表型性状指标。Dong等利用该系统研究了537份箭箐豌豆种质种子的表型性状，表明种质问的种子表型性状存在显著差异：杨正禹等以132份胡枝子属种质种子为材料，基于数字图像评估了胡枝子种子形态特征和基因型存在的显著关联性。

本研究以59份苜蓿种质种子为材料，基于数字图像对种子形态特征进行多样性分析，并评估分析59份苜蓿种质种子表型性状的方差分量、遗传力和遗传增益，继而对59份苜蓿种质进行综合评价，以期为我国西南喀斯特山区选择优良基因型苜蓿种子用于生产和苜蓿种质遗传改良研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试59份苜蓿种质种子，48份为中国农业科学院草原研究所国家牧草种质中期库提供，剩余11份（1、2、3、4、5、343、366、440、525、712和801）为贵州众志恒生态科技有限公司和北京正道种业科技有限公司提供（表1）。

1.2 试验方法

本研究于2022年7月对54份紫花苜蓿种质种子、3份杂交苜蓿种质种子和2份黄花苜蓿种质种子进行分析，共测定7个种子性状指标，分别为种子长（seed length）、种子宽（seed width）、长宽比（width to length ratio）、种子周长（perimeter）、种子形状系数（forrn coe伍cient）、百粒重（100 -seed weight）和种子厚（seed thickness）。除种子百粒重为100粒种子重量外，其余性状均为每份种质测量90粒种子，重复3次。扫描期间实验室保持20℃和20%的相对湿度，以避免种子形态发生显著变化。

使用光学平板扫描仪（V800 PHOTO，Epson，日本）对每份种质种子进行扫描，获得种子图像，图像分辨率为300 dpi，像素为1 024×1 024。之后使用数字图像分析系统（WinFOLIA 2014，加拿大）对种子图像进行分析，得到种子长、种子宽、长宽比、种子周长、种子形状系数。使用数显游标卡尺（AIRAI SR44，精度0.01 mm，中国）测量种子厚。电子天平（Mettler Toledo-MS204S，精度0.000 0 g，瑞士）称量种子百粒重。

1.3 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016对试验数据进行整理，用Origin Pr0 2021软件（OriginLab，美国）作图，并使用Genstat 22nd软件（VSN International，英国）进行方差齐性检验，并对种子性状数据进行方差分析，基于单因素方差分析（One - WayANOVA）的最小显著性检验（LSD）法得到性状平均值（Mean）。基于均值利用OriginPro 2021软件的模式聚类分析，通过控制数据质量以图像方式直观展示本研究中59份种质种子表型数量性状的差异变化情况，选用基于平方欧氏距离的最长距离法对59份种质种子表型性状指标进行聚类分析。为了消除量纲对聚类关系的影响，种质种子性状数据通过。值标准化后再进行聚类，其中，。值标准化计算公式如下：

x*=x- -x/σ。（1）

式中，x*为z值标准化后的数值，x为原数值，-x为样本均值，σ为样本标准差。

在GenStat 22nd软件中使用基于残差最大似然（residual maximum likelihood，REML）的混合线性模型进行方差分量分析，得到基因型方差分量（δ2g）和实验误差方差分量（δ2e）。表型方差系数（PCV）和基因型方差系数（GCV）通过从各自的方差分量得出的值计算。根据Johnson等的研究，表型方差分量（δ2p）、广义遗传力（H2b）、PCV和GCV的计算方式如下：

表型方差分量（8：）计算公式[19]：

δ2p=δ2g+δ2e/r。（2）

式中，r为重复次数。

广义遗传力（H2b）计算公式：

H2b（%）=δ2g/δ2p×100。（3）

表型方差系数（PCV）计算公式：

PCV（%）=根号下δ2p/Mean×100。（4）

式中，Mean代表种子某一表型性状的平均值。

基因型方差系数（GCV）计算公式：

GCV（%）=根号下δ2g/Mean×100。（5）

式中，Mean代表种子某一表型性状的平均值。

采用布雷金多性状综合评价法对种子表型性状进行综合评定，公式为：

式中，ai=Xij／Xjmax，Xij代表种子某一性状的平均值，Xjmax代表种子某一性状的最优值。

遗传增益ΔG计算公式：

ΔG（%）=H2b×S/Mea×100。（7）

式中，s为选择差，为种质种子性状的平均值与选择群体性状平均值的差值。

2 结果与分析

2.1 59份苜蓿种质种子表型性状多样性分析

59份苜蓿种质种子表型性状的分析结果（表2）表明，各种质问的种子表型性状均存在极显著差异（P＜0.01）。除种子形状系数、百粒重和种子厚外，其余种子表型性状的变异系数（CV）均大于10%，种子长宽比的最大，为35. 18%，百粒重的最小，为1 .87%。

2.2 59份苜蓿种质种子表型性状相关遗传变异系数和广义遗传力评估

对59份苜蓿种质种子的基因型方差分量（δ2g）、表型方差分量（δ2p）、实验误差方差分量（δ2e）、表型方差系数（PCV）、基因型方差系数（GCV）和广义遗传力（H2b）的分析结果（表3）表明，PCV和GCV值分别在4.18% - 27. 66%和1.11% - 27.30%之间，各种子表型性状中百粒重的PCV和GCV均最大。所有性状中百粒重的H2b值最大，达99.87%；种子厚次之，为67.84%；种子长宽比的H2b值最小，为7.17%。

2.3 59份苜蓿种质种子表型性状的聚类分析

通过聚类热图分析看出，当欧式距离为50时，59份苜蓿种质可分成三大类群（图1）。其中，第1类群包括5份种质，编号为712、525、440、343和28，结合热图可以看出，该类群种质除种子长外，其余种子性状值（种子周长、种子宽、长宽比、百粒重、种子厚和形状系数）均大于其它类群，表明该类群种质主要特点为种子形态大、种子重量较重，综合性状好。第Ⅱ类群包含20份种质，该类群种质种子长和种子周长值较大，但种子宽和形状系数均较小，表明该类群种质种子形态整体呈狭长特征，种子重量较轻。第Ⅲ类群包含34份种质，除编号为1、3这2份种质外，该类群其它种质的种子性状值整体均低于I、Ⅱ类群，表明该类群种子较小、种子重量轻，综合性状较差。

2.4 59份苜蓿种质种子表型性状的主成分分析及表型性状的相关性

对59份种质的7个性状进行主成分分析，结果（图2）显示，主成分1贡献率为37.70%，主成分2贡献率为30. 40%，累计达68. 10%。由图3可见，种子周长与种子厚、种子宽、种子长呈极显著正相关（P＜0.001，方向向量间角度＜90°），而与长宽比、百粒重呈显著正相关（P＜0.05）。种子长与长宽比呈极显著负相关（P＜0.001，方向向量间角度＞90°），与种子形状系数也呈极显著负相关（P＜0.01），与种子厚呈显著正相关（P＜0.05）。种子宽分别与长宽比、种子厚和种子形状系数呈极显著或显著正相关。种子长宽比与种子形状系数呈极显著正相关（P＜0.01）。在相关显著的性状中，种子宽和长宽比的正相关系数最大，为0. 82，而种子长与长宽比的负相关系数最小，为-0.59。

2.5 59份苜蓿种质种子遗传增益分析及综合评价

按5%的人选率评估各苜蓿种质种子表型性状的遗传增益（表4），种子周长遗传增益入选的3份种质编号为712、5和28，种子长遗传增益人选的3份种质编号为2、5和801，种子宽遗传增益人选的3份种质编号为712、440和525，长宽比遗传增益人选的3份种质编号为712、440和47，种子形状系数遗传增益人选的3份种质编号为801、712和1，百粒重遗传增益人选的3份种质编号为801、21和5，种子厚遗传增益人选的3份种质编号为43、801和5。人选种质种子性状遗传增益最高的种质为编号801的百粒重，达48.63%，而最低的为编号1的种子形状系数，为0.25%。

采用布雷金多性状综合评价法，以种子长、种子宽、长宽比、种子周长、种子形状系数、百粒重和种子厚这7个性状为指标对各种质进行综合评价，所得Qi值是多性状综合评价得分，其数值越大表示整体表现越好，结果（表5）显示，编号712的Qi值最大，为2.381。利用Qi值，按照10%的人选率对种质进行选择，编号为712、440、5、28、801、525的苜蓿种质人选，表明这6份种质的种子表型性状整体表现优良。

3 讨论与结论

遗传和变异是植物育种研究的重要内容，而遗传变异的来源、特点和规律是进行种质改良和下一步育种的重要基础。Chen等研究发现，种子大小与种子萌发时间有显著相关性；李娘辉研究表明，大粒种子能提高出苗速度、出苗率，花芽分化增多，最终促使作物高产。因此种子形态性状信息可以为品种选育提供重要信息依据。本研究结果表明，来自我国部分地区和美国、前苏联、意大利等国家的59份苜蓿种质的种子性状均存在极显著差异（P＜0.01），显示这些种质问差异较大且种质内存有潜在可用的遗传变异。不同来源的不同地理环境使得种子性状变异差异明显，可进一步进行优良种质种子的选择。

不同种质问存在的遗传多样性是选择优良基因型进行种质改良和育种的重要基础，较高的广义遗传力（H2b）是作物种质改良及表型性状育种过程中参考的重要指标。遗传力指亲本的某一性状遗传给子代能力的大小，能够反映群体中根据表型值的优劣选择基因型值的可靠程度。本研究中，种子百粒重的H2b明显高于其它种子表型性状（＞90%），这表明相较其它种子表型性状，种子百粒重遗传性稳定，受外界环境影响较小，在繁育过程中能够稳定遗传优良性状。因此，百粒重可作为种质改良及品种选育的重要参考性状。

种子表型性状多为连锁遗传，因此在种子表型多样性研究中，性状之间的相关性分析十分重要。本试验相关性分析结果表明，种子百粒重除与种子周长显著相关外，与其它性状的相关性均较低，表明苜蓿种子百粒重与种子大小、种子形状可能为独立遗传，种子重量受种子大小和形态影响小。除百粒重外，其它种子表型性状两两之间多呈显著相关关系，表明种子生长发育过程中各性状关联紧密，用多指标测定评价种子表型性状具有重要意义。

本研究中，通过聚类热图分析可将59份不同来源的苜蓿种质划分为三大类。其中，第1类群种质的种子形态大、重量重、综合性状好，该类群种质除编号28的种质外全部为国外引进的育成品种，而28号野生种质种子较大，后期育种中可以优先考虑应用。可见，通过引进国外优良苜蓿品种并选取其优良基因，是获得优质种源、缩短育种周期的重要途径。第Ⅱ类群种质的种子形态整体呈狭长特征、形态较大，但除编号801的种质外其余种质种子重量较轻。第Ⅲ类群种质的种子较小、重量轻、综合性状差。大粒种子对提高幼苗抗性和作物产量具有十分重要的意义，在特定生长环境中植物种子大小对其幼苗的建植和存活具有显著影响，较大的种子在幼苗阶段能够忍受外部环境改变引起的多种胁迫。在中国西南亚热带喀斯特山区，土壤石漠化程度较重，特殊的石灰岩地质结构导致该地区牧草在生长早期易遭受酸铝、钙盐等非生物胁迫，因此，该地区应尽可能地选育有利于牧草幼苗建植和存活的大粒种子苜蓿。

遗传增益的大小受遗传力的影响，而遗传力和遗传增益是衡量作物性状变异特点及子代性状受遗传控制程度的指标。李肇锋通过评估26份风藤种质种子表型性状的遗传增益，表明采用表型和遗传增益相结合方法进行风藤遗传改良选择成效显著，并筛选出一批性状优良的种子。本研究通过评估不同苜蓿种质种子表型性状的遗传增益及对种子性状进行综合评价，初步选出6个种子表型性状较好的种质，其编号分别为712、440、5、28、801和525。此外，21号种质种子百粒重的遗传增益明显高于其它种质，也可专用于后期种质种子重量的遗传改良。

本研究基于表型性状评估了59份苜蓿种质种子的表型变异和遗传变异参数。参试59份苜蓿种质种子表型性状遗传变异较大，7个表型数量性状间具有广泛的显著相关性，各种质种子的表型性状多样性较丰富。通过聚类热图分析看出，当欧式距离为50时，59份苜蓿种质可分成三大类群。结合遗传力和遗传增益进行综合评价，编号为712（WL712）、440（WIA40HQ）、5（维多利亚）、28、801（巨能801）、525（WL525HQ）、21（无棣苜蓿）的这7份种质种子的综合性状较好。本研究结果可为苜蓿种质种子性状改良、选种育种提供一定参考。

基金项目：国家自然科学基金项目（32260340，32060391）；贵州省科技计划项目（黔科合支撑[2021]一般155，黔科合平台人才 [2021]5636号）；贵州省教育厅科技拔尖人才项目（黔教技[ 2022）076号）