鸡传染性法氏囊病毒新型变异株致病性研究

摘 要：鸡传染性法氏囊病是一种由鸡传染性法氏囊病毒引起的急性、高传播性和致死率的烈性传染病，鸡感染该病毒后会引起法氏囊器官严重萎缩，导致机体产生免疫抑制。近年来IBDV新型变异株在我国开始流行，目前尚无商品化疫苗预防该病，未来可能成为养禽业健康发展的新威胁。因此，需要进一步研究其流行病学情况和在临床疾病可能发挥着潜在的作用。本研究针对新型变异株GD2021-08进行致病模型建立，为生产防控提供参考和指导。

关键词：鸡传染性法氏囊病毒；新型变异株；致病模型

中图分类号：S858.31 文献标识码：A 文章编号：1673-1085（2024）11-0021-07

传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD），是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高传播性且具有免疫抑制性的传染病，会增加诱发其他禽类疾病继发的可能性或其他疫苗接种失败的风险[1]。IBDV通常易感染3～6 周雏鸡，该病一年四季都可以发生，在4～7月份多发，发病率极高，达80%～100%。发病过程持续一周且极为迅速，通常在感染3 d后即可引起法氏囊萎缩，开始出现死亡，感染4～6 d达到高峰，死亡率为5%～15%，感染并发症后死亡率会更高，因此该病还被称为鸡中的“艾滋病”[2]。IBDV主要严重损害雏鸡中枢免疫器官——法氏囊，使B淋巴细胞前体坏死或溶解，从而影响鸡的发育以及抗体的产生。临床症状主要有精神萎靡、羽毛蓬松杂乱、少食、间歇腹泻等。解剖病鸡可以发现法氏囊黏膜有出血、严重时法氏囊发黄甚至呈紫葡萄状[3]。

1957年，IBD首次发生于美国Delaware州甘保罗镇。根据发病地区，该病被命名为Gumboro disease，即甘保罗病[4]。1979年首次在我国广州出现，周蛟等人在北京发现并于1982年分离出该病毒，随后陆续在全国流行[5-6]。后来，疫苗的研发使这类经典IBDV得到有效控制，感染IBDV的鸡死亡率不高。

最近几年来，随着A、B节段不断的重组重配，中国东部报道IBDV新型变异株出现。在2019年，中国从6个省份中首次检测到新型变异株IBDV。这引起了人们对新型变异株的广泛关注，国内陆续有人分离并对IBDV新型变异株进行各方面研究[7]。新型变异株也迅速传播到了其他亚洲国家，2021年在日本、韩国、马来西亚等国陆续发现IBDV新型变异株[8-9]。IBDV新型变异株可能成为家禽业新的威胁，防控形势仍不容乐观。

本研究前期从临床中分离到一株IBDV新型变异株GD2021-08，为了解该毒株临床致病情况。本文通过该毒株在SPF鸡上的感染情况以及发病特征进行研究，为生产防控提供参考和指导。

1" 材料方法

1.1" 材料

1.1.1" 病毒" 毒株：本试验用到的IBDV新型变异株代表株GD2021-08，由温氏研究院分离纯化鉴定。

1.1.2" "SPF鸡胚、试验动物" 无特定病原体（Specific pathogen free，SPF）鸡、SPF鸡胚均购于广东温氏大华农生物科技有限公司。鸡胚在37 ℃培养箱中孵育，SPF鸡在试验场负压隔离器中饲养。

1.1.3" 主要试剂" 病毒基因组提取试剂盒（RaPure Viral RNA/DNA Kits），购自Magen生物公司；PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit， Ver.2 （Dye Plus）一步法反转录试剂盒，购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒（E.Z.N.A. ® Gel Extraction Kit）、质粒DNA抽提试剂盒（E.Z.N.A.® Plasmid DNA Mini Kit I），Omega公司产品； In-Fusion® HD Cloning Plus，购自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS），购自Bovogen公司；DMEM购自Hyclone公司。

1.1.4" 主要仪器设备" PCR仪、电泳仪，美国伯乐生命医学产品有限公司；凝胶扫描成像系统，美国Syngene公司；超纯水系统，美国Millipore公司；磁力搅拌器，美国IKA公司；漩涡振荡器，杭州仪表电机厂；超声细胞破碎仪，南京新辰生物科技有限公司；普通水平离心机，艾本德中国有限公司；冷冻离心机，艾本德中国有限公司；超速冷冻离心机，美国Beckman公司；-80 ℃超低温冰箱，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CO2培养箱，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；-4 ℃超低温冰箱，中国中科美菱低温科技有限责任公司；天平，多利斯（上海）贸易有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" IBDV新型变异株代表株GD2021-08的分离鉴定" 本研究以IBDV变异株GD2021-08为IBDV新型变异株代表株，将其在SPF鸡上盲传3代分离纯化GD2021-08，得到IBDV新型变异株GD2021-08胚毒。对IBDV VP2基因进行检测，通过PCR检测外源病毒混合感染情况。

1.2.2" IBDV新型变异株代表株GD2021-08的TCID50测定" IBDV变异株GD2021-08的TCID50通过免疫间接荧光试验（IFA）来检测，将2.3.4中的-80 ℃冻融的已过滤研磨上清液用10%FBS的DMEM（F12）培养基依次倍比稀释10倍接种到CEF细胞上，共稀释11个梯度，每个梯度设复孔加培养液8孔/100 μL，37 ℃条件下CO2培养箱孵育36 h后测定病毒效价。

1.2.3" IBDV新型变异株GD 2021-08的最小攻毒剂量的确定" 将GD2021-08连续做10倍倍比稀释，分别按照2×104、2×103、200、20 TCID50/0.2 mL的剂量以点眼滴鼻的方式接种28日龄SPF鸡，设3组剂量，每组10只鸡，设空白对照组10只鸡，每只鸡接种PBS/0.2 mL，见表1。攻毒后第7天（7 dpi），解剖所有鸡，剖检并称量体重。

1.2.4" 致病性试验方案及其分组" 为了研究IBDV新型变异株GD2021-08对SPF鸡的致病性，将45只16日龄的SPF鸡随机分为3组，感染组（21只）、空白对照组（4只）、观察组（10只）。感染组、观察组SPF鸡在16日龄以点眼滴鼻的方式感染200 TCID50/0.2 mL，IBDV新型变异株GD2021-08，空白对照组在相同日龄注射同等剂量的PBS溶液。攻毒后1～7 d，每天观察鸡临床症状、存活情况并称重，随机剖检感染组3只和空白对照组2只鸡，采集法氏囊和脾脏，观察法氏囊、脾脏病变情况，依据（1-1）式、（1-2）式计算囊重比和脾重比；根据（1-3）式计算囊重指数（Bursa：body-weight index， BBIX）。分别在攻毒后第1、3、5、7 天剖检的法氏囊用4%甲醛固定，送武汉塞维尔生物科技有限公司进行组织病理切片分析。观察组感染后观察临床症状，统计存活率、发病率，在攻毒后第25 天，对存活鸡进行称重，观察体重变化。

囊重比＝（法氏囊重量/体重）× 1000" "（1-1）式

脾重比＝（脾脏重量/体重）× 1000" "（1-2）式

BBIX＝攻毒组鸡囊重比/空白对照组鸡平均囊重比 （1-3）式

当BBIXlt; 0.7时，判定法氏囊萎缩。

2" 结果

2.1" 存活率、发病率及体重变化

通过连续25 d对观察组的存活率统计，发现没有鸡死亡，也没有明显临床症状出现，存活率100%，见图1。但通过称重发现感染7、25 d时观察组的体重较空白对照组体重有所减轻，见图2。

2.2" 感染后剖检结果

为了进一步评估IBDV新型变异株GD2021-08导致的病理损伤，攻毒后1～7 d进一步对感染组、空白对照组进行剖检，剖检结果如图3所示。感染后3 d法氏囊较空白对照组有明显萎缩、发黄，脾脏则无显著变化，说明IBDV新型变异株GD2021-08能导致法氏囊病理损伤。

称重统计后通过脾重比（图4）、囊重比（图5）和BBIX指数（图6）发现，感染组在攻毒后的第3天时囊重比快速下降，在攻毒后的第3～7天囊体比与空白对照组相比有极显著差异（Plt; 0.001），脾重比在感染初期的第2、4 天肿大，在2、4、6 dpi时与空白对照组相比有极明显差异（Plt; 0.001），BBIX指数图中明显可看出囊指数在感染后1～7 d逐渐下降，3 d后低于0.7。该结果与解剖结果一致，证明IBDV GD2021-08株对鸡有明显致病性。

2.3" 法氏囊病理切片结果

法氏囊组织切片结果如图7。发现感染IBDV新型变异株GD2021-08组攻毒后的第3 天法氏囊开始出现明显病理损伤，皮髓质淋巴细胞坏死、溶解、大量减少，上皮细胞大量增生（红色箭头所指），结缔组织增生（黄色箭头所指），有炎性细胞浸润（绿色箭头所指），在感染后的第7 天时伴有囊肿形成（蓝色箭头所指）。在空白对照组的鸡中未观察到明显的病理损伤。

3" 讨论

IBD是一种可引起免疫抑制的急性传染病，可造成疫苗接种失败。免疫失败的原因可能与抗原变异、重组错配有关。变异株主要流行于北美洲，带来巨大经济损失[10]。但在2015年有研究发现我国东部多省从免疫鸡群检出多株变异株，经检测证实是不同于美国早期变异株的新型变异株。该毒株对鸡不致死，可引起法氏囊严重萎缩，导致强烈免疫抑制，引起广泛关注，未来可能成为养禽业新的威胁[11]。目前中国IBDV新型变异株的流行情况报道很少，因此，进行IBDV新型变异株流行病学调查是十分必要的。通过遗传进化分析阐明流行病学特征，评估流行传播与遗传进化趋势，为IBDV的有效防控和疫苗研发提供数据支持。

IBDV有两种血清型，即血清Ⅰ型和血清Ⅱ型。血清I型有独特的嗜法氏囊性，在鸡的法氏囊中复制并引起免疫抑制，血清II型虽然可以感染火鸡的不同组织，但对鸡是非致病性的[12]。这两种血清型可以通过病毒中和试验（VN）和聚合酶链式反应（PCR）来鉴别，但使用间接免疫荧光（IFA）和ELISA测定方法无法区分，只能检测出两者共有的常见抗原。血清I型根据致病性和抗原性可大致分为四种：经典毒株（Classical IBDV，cIBDV）、变异株（Variant IBDV）、vvIBDV超强毒株（Very varient IBDV）、新型变异株（Novel varient IBDV），它们会产生不同的致病结果[13]。IBDV基因组由双节段双链RNA（dsRNA）——A、B片段构成。较大片段A和较小片段B都有5'末端非编码区（5'-noncoding region，5'-NCR）、3'末端非编码区（3'-noncoding region，3'-NCR）和编码区[14]。最近几年来，随着A、B节段不断的重组重配，中国东部出现IBDV新型变异株。在2019年，中国从6个省份中首次检测到新型变异株IBDV[15]。这引起了人们对新型变异株的广泛关注，国内陆续有人分离IBDV新型变异株并对其进行各方面研究。

为了评估IBDV新型变异株的致病性。本文用IBDV新型变异株GD2021-08感染16日龄SPF鸡，建立致病模型。结果表明IBDV新型变异株GD2021-08株导致鸡群体重明显减轻，剖检发现攻毒鸡群法氏囊明显缩小且重量减轻，进一步制作组织病理切片进行观察，发现法氏囊有明显的病理损伤，皮髓质淋巴细胞坏死、溶解、大量减少，上皮细胞大量增生，结缔组织增生，有炎性细胞浸润，并伴有囊肿形成。法氏囊作为鸡主要的中枢免疫器官，与体液免疫有关，可以影响淋巴B细胞的发育。病理结果说明该变异毒株对鸡群免疫系统造成巨大损伤，严重影响鸡群生长发育，会给生产带来潜在的经济损失。

4" 结论

本文对IBDV新型变异株GD2021-08致病性进行研究，结果表明该毒株引起鸡群体重减轻以及明显的法氏囊萎缩和炎性病变，虽然不直接引起鸡群的死亡，但是给鸡群的生长性能带来了巨大的危害，本模型对生产防控提供临床参考和指导。

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532-536.

收稿日期：2024-08-14

基金项目：“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向 “揭榜挂帅”项目（重大动物疫病新型综合防控技术）

第一作者：李群辉（1988—），男，博士，主要从事畜禽疾病防控，E-mail：492992437@qq.com

通信作者：王连想（1975—），男，博士，高级兽医师，主要从事畜禽疾病防控和临床生产管控，E-mail：animsci@126.com